第五章酶与细胞固定化技术

第五章 酶与细胞的固定化技术

教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。

教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体

第一节 概述

一、游离酶使用中的局限性:

1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究

克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始

60年代后期，固定化技术迅速发展

1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme)

指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复

利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。

2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但

细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用

酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化

拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）

第二节、酶的固定化方法

一、酶的固定化方法

1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法

3）交联法 4）化学共价法

其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴ 酶的性质

⑵ 载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶ 制备方法简便易行 ⒊ 衡量依据：

⑴ 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；

⑵ 研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶ 稳定性和不稳定原因的探究；

⑷ 对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法

1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。

此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。

2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。

3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；

缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂

各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟

基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例：

将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS中备用。

（二） 包埋法

1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。 可分为凝胶包埋法

（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。

2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高；

缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、 海藻酸盐包埋法

海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

缺点:

在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定. Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解 优点:

海藻酸盐价格便宜 包埋条件温和 4、角叉菜糖包埋法

K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即

生成凝胶. 缺点:

对高浓度的Na+离子敏感

固定化温度高,需要在37℃~55℃ 5、聚丙烯酰胺凝胶

在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N’-甲撑

双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶 缺点:

丙烯酰胺对酶具有变性作用 6、聚乙烯醇（PVA）包埋法

磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法 硼酸硬化法:

将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液

(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中 优点:

原材料价格便宜 条件温和 无毒害作用 循环冷冻法 硼酸硬化法 7、半透膜包埋法 7.1 界面沉淀法

利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。 操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶的有机相中乳化形成油包水的微滴，再将

溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有机相移入水相。

7、半透膜包埋法 7.2界面聚合法

利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。 例:

将含10%血红蛋白的酶液与1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盘-85的氯仿-环己

烷中分散乳化，再加入溶于有机相的葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。

（三） 交联法 基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构，以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成席夫碱（基）Shiff 碱将酶固定化。含氨基的载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。 交联剂的特点：①带有二个以上的功能基团。②反应比较剧烈条件比较严格。③操作方 便，活力回收不高。

固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。 交联法有5种形式： ①酶直接交联法

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子交联，活力回收往往不高。 ②酶辅助蛋白交联：为避免分子交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经-30℃低温处理，再预热至4℃而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。

③吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上。 ④载体交联法：

用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚。

⑤交联包埋法：

把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好 戊二醛交联法 缺点：

双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。 为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助

蛋白。

（四） 化学共价法 1、概念

所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通过共价键和不溶性载体形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反应

2、用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团:

1）氨基-赖氨酸上的ε-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的α- 氨基;

2）羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的α- 羧基; 3）酪氨酸上的苯酚环; 4）半胱氨酸上的巯基;

5）羟基-丝氨酸,氨酸以及酪氨酸上的羟基 6）组氨酸上的咪唑基; 7）色氨酸上的吲哚基 其中以氨基和羧基为最常用

3、一般认为共价法的特点如下：

① 酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长。 ② 制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化。 ③ 制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。

④ 载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH，浓度的改变。 4、常用载体

⑴ 天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂糖（Agarose Sepharose），卡那胶，淀粉以及它们的衍生物。（利用-OH） ⑵ 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2） ⑶ 无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一个基团） 5、 技术要点

⑴ 将所选用的载体上的有关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应。（直接 活化或另接一反应基团）

⑵ 在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂） 6、分类：

⑴重氮法；⑵ 叠氮法；⑶ 缩合法； ⑷ 烷化反应法；⑸ 硅烷化反应法； ⑹溴化氰法。 ⑴ 重氮法

目前在我们国用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，用这些载体制备了不少固定化酶。 方法原理如下：

① 用双功能试剂β - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），连接于被活化（-OH）的纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。

② 在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。 ③ 把酶偶联于ABSE-纤维素上 ⑵ 叠氮法

是在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。

主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。

例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴ 酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴入HCl 气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。⑵ 肼解:把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1 小时，过滤，甲醇洗涤干燥。⑶ 叠氮化:肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2 反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶，防止戊二醛的另一醛再与载体上另一个-NH2 反应。(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（含250-500mg 酶），5℃搅拌2-3 小时，过滤用 0.001N HCl，