中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

由天下分享时间：2025/2/25 4:01:42 加入收藏我要投稿点赞

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2024，50（8）：1851-18598期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1851·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2024.08.28中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、

药敏特性及其组织病理学观察

2，32，3

周慧华1，，黄晓东1，，安

2，3*2，3

健4，曹海鹏1，，杨先乐1，

（1国家水生动物病原库（上海海洋大学），上海

201306；2上海水产养殖工程技术研究中心（上海海洋大学），上海

201306；

222000）

201306；

水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心（上海海洋大学），上海

连云港市海洋与渔业发展促进中心，江苏连云港

摘要：【目的】查明引起江苏省连云港市某养殖场中华绒螯蟹死亡的病原菌及其药敏特性与组织病理特征，为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据。【方法】采用传统方法从患病中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌，通过人工回归感染试验确定其致病性，利用APIID32E细菌生化鉴定试剂条和16SrRNA序列分析对病原菌进行鉴定，以纸片扩散法测定病原菌的药敏特性，并通过常规石蜡切片观察患病中华绒螯蟹肝胰腺和肠道等病灶组织的病理特征。【结果】从患病中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株具有致病性的病原菌株（HXH1），经生理生化特性鉴定和16SrRNA序列分析确定其为维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）。HXH1菌株对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）为6.92×104CFU/mL，对复方新诺明、杆菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素和甲氧嘧啶等14种抗生素高度敏感，对罗红霉素中度敏感，对多西环素、萘啶酸、阿莫西林、四环素和吡哌酸等5种抗生素已产生耐药性（不敏感）。与健康中华绒螯蟹相比，患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道存在明显病理变化，具体表现为：肝胰腺细胞排列极其紊乱，局部可见坏死细胞，细胞核固缩深染；局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内。【结论】维氏气单胞菌对中华绒螯蟹具有较强的致病性，通过引起肝胰腺和肠道等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡，养殖生产上可选用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类渔用抗生素进行防治。

关键词：中华绒螯蟹；维氏气单胞菌；分离鉴定；药敏特性；组织病理特征中图分类号：S945.6

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2024）08-1851-09

Isolation，identificationandantibioticsusceptibilityof

pathogenicAeromonasveroniiinEriocheirsinensisandits

histopathologicalobservations

2，32，32，3*

ZHOUHui-hua1，，HUANGXiao-dong1，，ANJian4，CAOHai-peng1，，

1，2，3

YANGXian-le

（1NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals（ShanghaiOceanUniversity），Shanghai201306，China；2

ShanghaiEngineeringResearchCenterforAquaculture（ShanghaiOceanUniversity），Shanghai201306，China；3

ShanghaiCollaborativeInnovationforAquaticAnimalGeneticsandBreeding（ShanghaiOceanUniversity），Shanghai

201306，China；LianyungangCityOceanicandFisheryDevelopmentCenter，Lianyungang，Jiangsu222000，China）Abstract：【Objective】ThepresentstudywasconductedtoinvestigatethebacterialpathogenthatcausedthedeathofEriocheirsinensisfarmedinLianyungang，Jiangsuanddetermineitsantibioticsusceptibilityandhistopathologicalcharac-terizationinordertoprovidereferenceforclinicaldiagnosisandeffectivecontrolofthisdiseaseinE.sinensisaquaculture.【Method】BacterialisolateswereisolatedfromnaturallyinfectedE.sinensisusingtraditionalmethodsandthepathogenici-tywasdeterminedbyartificialinfectiontest.ThepathogenicisolatewasidentifiedbyAPIID32Ebiochemicalidentifica-tionreagentstripand16SrRNAsequenceanalysis.Itsantibioticsusceptibilitywastestedbydiscdiffusionmethod，andthehistopathologicalcharacterizationofpancreasandintestinaltractthediseasedE.sinensiswasfurtherobservedbycon-ventionalparaffinsectiontechnique.【Result】ThepathogenicstrainHXH1wasisolatedfromhepatopancreasofdiseased收稿日期：2024-12-18基金项目：江苏省海洋与渔业科技创新与推广项目（Y2024-8）作者简介：*为通讯作者，曹海鹏（1981-），博士，副教授，主要从事水产动物病害与防控研究工作，E-mail：hpcao@shou.edu.cn。

周慧华（1994-），主要从事水产病原微生物控制研究工作，E-mail：1305463585@qq.com

·1852·南方农业学报50卷E.sinensisandwasidentifiedasAeromonasveroniibasedonphenotypiccharacteristicsand16SrRNAsequencesanalysis.

Ithadanmedianlethaldose（LD50）of6.92×104CFU/mLforhealthyE.sinensisandshowedhighsusceptibilitytocompoundsulfamethoxazole，bacitracin，netilmicin，florfenicol，polymixinB，neomycin，gentamycin，ofloxacin，norfloxacin，en-rofloxacin，kanamycin，sulfisoxazole，streptomycin，trimethoprim，moderatesusceptibilitytoroxithromycinandresis-tant（insensitivity）todoxycycline，nalidixicacid，amoxicillin，tetracyclineandpipemidicacid.Inaddition，comparedwithhealthyE.sinensis，thehepatopancreasandintestinaltractofdiseasedE.sinensishadobviouspathologicalchange.ThehepatopancreascellsofdiseasedE.sinensiswereirregular-arranged，appearedlocalnecrosiswithpyknoticnucleus，localepithelialtissuesofintestinalmucosaweredissolvedandfelloffintotheintestinalcavity.【Conclusion】A.veroniihashighpathogenicityforE.sinensiswhichinducesthebodydamagesandevendeathbycausingpathologicalchangesinhepatopancreasandintestine，fisheryquinolones，aminoglycosides，sulfonamidesandamphenicolsantibioticscanbeusedasareferenceforthecontrolofthisdisease.

Keywords：Aeromonasveronii；Eriocheirsinensis；isolationandidentification；antibioticsusceptibility；histopa-thologicalcharacterization

0引言

【研究意义】中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）是我国重要的特种水产养殖品种，年产量已超过81万t（农业部渔业渔政管理局，2017），具有很高的养殖经济效益，但随着养殖密度和规模的不断扩大，细菌性病害对中华绒螯蟹养殖产生了严重危害，且呈现出病原菌种类多、繁殖速度快、致病力强和发病率高的特点，通常引起中华绒螯蟹内脏组织出现不同程度的损伤而导致大规模死亡（徐欣等，2003）。因此，加强细菌性病害研究对促进中华绒螯蟹养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）是一种对水产养殖危害极大的致病菌，可导致斑点叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）（黄小丽等，2010）、齐口裂腹鱼（Schizothoraxprenanti）（谢光美等，2015）、虹鳟（Oncorhynchusmykiss）（王兴丽等，2016）、中华鲟（Acipensersinensis）（田甜等，2017）、凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）（张小明等，2017）、草鱼（Ctenopharyngodonidellus）（高彩霞等，2024）、达氏鲟（Acipenserdabryanus）（刘亚等，2024）、克氏原螯虾（Procambarusclarkia）（彭博文等，2024）、台湾泥鳅（Paramisgurnusdabryanusspp.Taiwan）（徐先栋等，2024）、鲫（Carassiusauratus）（朱潜等，2024）和泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）（袁雪梅等，2024）等多种水产养殖动物发生严重病害，给水产养殖业带来巨大经济损失。目前，国内外有关水产动物维氏气单胞菌的流行特点、临床特征、分类地位、耐药性、致病机理及免疫防控等方面已有较多研究报道（康雪微等，2017；高彩霞等，2024；康元环等，2024；Songetal.，2024；Lietal.，2024），但其病理诊断基础较薄弱，仅系统阐明斑点叉尾鮰（黄小丽等，2010）、齐口裂腹鱼（谢光美等，2015）、虹鳟（王兴丽等，2016）和达氏鲟（刘亚等，2024）等少数水产动物维氏气单胞菌病的组织病理特征，尤其随着

渔用抗生素的不合理使用，水产动物致病性维氏气

单胞菌的耐药性日益增强，在一定程度上严重影响了水产动物维氏气单胞菌病的防控效果。【本研究切入点】2024年8月江苏省连云港市某养殖场的中华绒螯蟹出现严重病情，其临床特征主要表现为病蟹行动迟缓，摄食减少或不摄食，肝胰腺呈暗黄色，肠道有脓状黏液，与已报道的中华绒螯蟹维氏气单胞菌病病症（房海等，2008；郑世雄，2013；姜光明等，2016）不完全相同，因此急需鉴定其病原并科学用药以减少经济损失。【拟解决的关键问题】通过对患病中华绒螯蟹进行病原菌分离鉴定、毒力检测及药敏试验，并观察其组织病理特征，以期为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

自然发病中华绒螯蟹取自江苏省连云港市某养殖场，共16只，平均体重114.6g/只；健康中华绒螯蟹由上海市某养殖场提供，共200只，大小均匀、体质健壮，平均体重20.1g/只。APIID32E细菌生化鉴定试剂条（法国梅里埃公司产）和药敏纸片（杭州滨河微生物试剂有限公司产）购自上海傲之珊实业发展有限公司。

1.2病原菌分离

参照曹海鹏等（2015）的方法，对自然发病中华绒螯蟹进行病原菌的分离与纯化，并观察分离菌株培养获得的菌落形态特征及菌体形态。1.3人工回归感染试验

人工回归试验设5个试验组和1个对照组，每组10只健康中华绒螯蟹。试验前参照曹海鹏等（2015）的方法制备分离菌株菌悬液，其中，试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射1.0×107CFU/mL的菌悬液（徐海圣等，2002），注射剂量0.1mL/只；对照组中华绒螯蟹注射等量无菌生理盐水。试验周期为7d，

8期周慧华等：中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

·1853·养殖水温控制在28℃，每天观察中华绒螯蟹的病症

及记录其死亡数量，并及时捞出死蟹再次进行病原菌分离，确定其致病性。1.4病原菌鉴定

采用APIID32E细菌生化鉴定试剂条对病原菌株进行生理生化鉴定（李莉等，2015），并对分离菌株进行16SrRNA序列PCR扩增及测序分析（房海等，2008），最后采用邻接法构建系统发育进化树，通过16SrRNA序列分析对分离菌株进行分子鉴定。1.5病原菌毒力测定

试验设4个试验组和1个对照组，每组10只健康中华绒螯蟹。试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射8.7×103~8.7×106CFU/mL的分离菌株菌悬液（徐海圣等，2002），注射剂量0.1mL/只；对照组中华绒螯蟹注射等量无菌生理盐水。试验周期为7d，养殖水温控制在28℃，每天观察中华绒螯蟹的病症及记录其死亡数量，及时捞出死蟹再次进行病原菌分离鉴定，并依据概率单位图解法测定分离菌株对中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）。1.6病原菌药敏特性测定

采用纸片扩散法测定分离菌株的药敏特性（Jo-sephetal.，2011），并根据杭州滨河微生物试剂有限

公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》判定

分离菌株对各抗生素的敏感度。1.7组织病理观察

取患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道等病灶组织，以健康中华绒螯蟹的相应组织为对照，通过常规病理组织学方法（杨宗英等，2024）制备石蜡组织切片，经HE染色后于光学显微镜下进行观察比较。

2结果与分析

2.1

病原菌分离结果

从患病中华绒螯蟹的肝胰腺中共分离获得5株疑似病原菌株，暂命名为HXH1、HXH2、HXH3、HXH4和HXH5。人工回归感染试验结果表明，仅HXH1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡，累计死亡率达100%（表1），其临床症状与自然发病中华绒螯蟹的病症（图1）基本一致，且从人工感染发病中华绒螯蟹肝胰腺中可再次分离到与HXH1菌株生理生化特性一致的菌株，由此判定HXH1菌株是引起中华绒螯蟹发病的病原菌。HXH1菌株在营养琼脂培养基上形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，米白色，中央略微隆起，不透明，革兰氏染色呈阴性，菌体呈杆状（图2）。

表1分离菌株对中华绒螯蟹的人工回归感染试验结果

Table1ResultsofartificialinfectioninE.sinensisbybacterialisolates

菌株Strain

HXH1HXH2HXH3HXH4HXH5

生理盐水Physiologicalsaline

菌悬液浓度（CFU/mL）试验蟹数（只）累计死亡蟹数（只）Totaldeadcrabnumber（ind）BacterialsuspensionCrabnumber第1d第2d第3d第4d第5d第6d第7dconcentration（ind）Day1Day2Day3Day4Day5Day6Day7

1.0×101081000000

1.0×10100000000

1.0×101000000000100000000

死亡率

（%）Mortality10000000

Fig.1