常压室温等离子体诱变选育春雷霉素高产菌株

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常压室温等离子体诱变选育春雷霉素高产菌株

作者：高嫚妮 潘忠成 杨玉旺 杨宏勃 陈豪 翁婧 李蒲民 来源：《绿色科技》2019年第24期

摘要：采用常压室温等离子体对春雷霉素生产菌株小金色链霉菌（ Streptomyces mlcroaureus） 203#进行诱变育种，采用不同时间等离子体照射诱变，再经过琼脂块筛选、摇瓶初筛和复筛，获得2株春雷霉素高产菌株，摇瓶效价分别为5012 μg/mL和4034 μg/mL，相比原始出发菌株203的效价提高了147%和98%。关键词：小金色链霉菌;效价;诱变选育;春雷霉素;常压室温等离子体中图分类号：TQ455.5 文献标识码：A

文章编号：16 74-9944（ 2019） 24-0001-04 1 引言

近年来，随着人们环保意识的加强，生物农药逐渐走人人们的视野。其专一性强，活性高，安全环保，不易产生残留和抗药性，对我国农业避免药害、合理用药、减缓病害抗药性、提高防治效果、减少农药残留有着重要意义。春雷霉素不仅能防治水稻稻瘟病[1]，对番茄叶霉病[2，3]、黄瓜细菌性角斑病[4，5]、白菜软腐病[6]等也具有抗菌作用。春雷霉素作为高效、广谱、低毒、无公害的生物农药，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药，展示了越来越光明的市场前景。

春雷霉素是属于氨基糖苷类抗生素，其产生菌为小金色链霉菌。菌种的高产和发酵工艺的优化关系到一个发酵行业的灵魂，能获得一株高产、稳定、适应性好的菌株，将会大大缩短产业化的路程。采用等离子体诱变和紫外照射诱变是目前常采用的有效诱变手段，以此来筛选抗生素高产菌株已广泛用于菌株选育程序中[7]。多杀菌素产生菌经过紫外诱变，筛选高产菌株已有研究报道[8]。汪晨等[9]以谷氨酸棒杆菌作为原始出发菌株，通过常压室温等离子体诱变技术，确定高产琥珀酸等离子体诱变的物理参数和最佳诱变条件，筛选得到具备良好的产琥珀酸与有机酸的能力的诱变菌。蔡聪等[1O]为进一步提高凝结芽孢杆菌发酵木糖生产L一乳酸的产量和转化率，以实验室保存的一株能利用木糖产L一乳酸的野生型凝结芽孢杆菌菌株NLOI为出发菌株，通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛，最终得到一株木糖耐受力强、L一乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株NL- CC- 17。常压室温等离子体（ ARTP）诱变筛选高乳糖酶活力乳酸克鲁维酵母的条件，以ARTP诱变育种方法为诱变手段，对乳酸克鲁维酵母进行不同时长（10 s依次增加到300 s）的诱变处理，并结合高通量筛

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选方法快速筛选出33株乳糖酶活力提高50%以上的突变菌株。通过复筛最终得到4株高乳糖酶活力的突变菌株[11.12]。白云[13]通过响应面的培养基的优化实现了多杀菌素发酵产量的有效变化，除菌株的高产特性外，菌株的适应环境的能力同样非常重要。 2 实验材料 2.1 实验仪器

常压室温等离子体诱变育种仪（ ARTP）：无锡源清天木生物科技有限公司;HZQ- X500C大型恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司;恒温恒湿箱：上海恒一科学仪器有限公司;LC-2030高效液相色谱仪：株式会社岛津制作所。 2.2 实验菌种

春雷霉素产生菌小金色链霉菌（Streptomyces ml-croaureus），由陕西麦可罗生物科技有限公司提供。 3 实验方法

3.1 小金色链霉菌斜面培养制备和斜面孢子计数

用接种铲将出发菌株接种到斜面培养基（葡萄糖1.0%，麦芽糖0.5%，蛋白胨0.1%，氯化钠0.1%，豆饼粉5.0%，碳酸钙0.1%，琼脂2.0%，其余水，pH自然，121℃灭菌20 min）上25～30℃培养9d，获得孢子斜面，再刮下斜面全部孢子，用灭菌生理盐水稀释108倍，涂布在含培养基（同斜面培养基相同组分）平皿上，28℃培养3d，单菌落计数，依据稀释比例计算斜面孢子总数。

3.2 小金色链霉菌常压室温等离子体（ ARTP）诱变处理

用接种铲铲取整个斜面孢子，加入含10 mL生理盐水的50 mL试管中，加入40颗玻璃珠，震荡4 min，用灭菌脱脂棉过滤去除菌丝片段，制成大浓度孢子悬液。再用灭菌生理盐水稀释至孢子浓度约为106个/mL。孢子悬液中加终浓度为5%灭菌甘油，混合均匀，取10μL涂于无菌载片上，距离照射源2 mm，分别照射O s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130s、140 s、150 s、160 s、170 s、180 s，立即分别稀释O倍、10倍、1000倍、10000倍、100000倍，取100 μL均匀涂布于平皿上，黑暗静止培养6～10 d，获得单菌落。

3.3 春雷霉素高产菌株筛选 3.3.1 琼脂块法筛选诱变后菌株

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制备双层平板，将灭菌后的下层培养基15 mL趁热倒入平板中，冷却30 min。上层培养基温度降至50℃左右，加入10%的春雷霉素指示菌枯草芽孢杆菌，轻摇混匀，取15 mL迅速铺于已制备好的下层培养基上，继续冷却至室温。用接种针挑取诱变后的单菌落，轻置于培养基上，37℃培养28 h，通过考察抑菌圈大小筛选出产春雷霉素的能力强的单菌落。

下层培养基：琼脂1. 5%，其余为水，pH自然。上层培养基组分：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1.0%、琼脂1.5%，其余为水，pH自然。 3.3.2 摇瓶发酵法筛选诱变菌株

初筛：从平板上挑选抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，28℃培养9d，获得孢子斜面。用接种铲从斜面將孢子接种到种子培养基（豆饼粉5. 0%，饴糖0. 5%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.5%，玉米油5.0%，其余为水，pH自然）中，28℃，200 r/min摇床震荡培养培养24 h，按2% （v/v）的接种量立即转接至发酵培养基（黄豆饼粉5.0%，磷酸二氢钾0.50%，氯化钠0.5%，玉米油5.0%，其余为水，pH自然。）中，继续进行发酵培养170 h，获得含不同浓度春雷霉素发酵液。

采用高效液相色谱分析方法测定发酵液中春雷霉素的含量，所用色谱条件：5 μm ODS不锈钢柱;流动相：乙腈一1. O%SDS水溶液（体积比20：80）;流速：1.2mL/min;可变紫外检测器：波长215 nm。依据峰面积计算发酵液中春雷霉素的含量，并选取含量高于对照10%的菌株进行复筛。复筛：重复初筛操作，对初筛的高效菌株进行复筛，最终筛选出春雷霉素高产菌株。

3.3.3 春雷霉素高产菌株的传代稳定性考察

将筛选出来的高产菌株转接至斜面培养基，在28℃恒温干燥培养箱中避光培养9d，对斜面菌种再次转接至斜面培养基上，重复操作5次。分别将这六次培养获得的斜面菌株接种至种子培养基中，28℃，220 r/min摇床震荡培养培养40 h，按2% （v/v）的接种量立即转接至发酵培养基中，继续进行发酵培养170 h，获得含不同浓度春雷霉素发酵液，采用HPLC测定发酵液中春雷霉素的含量。 4 结果分析

4.1 小金色链霉菌斜面培养制备和斜面孢子计数

用接种铲将带菌斜面全部铲进10 ml_无菌蒸馏水中，经稀释涂布，菌落计数，发现一个带菌斜面含有孢子数约为2.5×109个。 4.2