欧阳育创编 2021.02.04 欧阳育创编 2021.02.04
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后成长起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在植物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
时间：2021.02.04 创作：欧阳育 关键词：恒温扩增；PCR 引言：
近年来，随着分子生物学技术的迅速成长，基于核酸检测的诊断办法已年夜量建立并广泛应用于植物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此布景下呈现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经呈现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测办法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在植物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在植物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增
1. 1 滚环核酸扩增的原理
滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方法而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产品是具有年夜量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅
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限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA原理与线性RCA 相同，采取与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产品结合并酶促延伸，其产品又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产品呈指数递增。指数RCA 可用于非环状DNA 的扩增，增倍数能达107[2]。 1. 2 滚环核酸扩增的优势与缺乏 RCA 的优势：(1) 高灵敏度。RCA有很强的扩增能力，线性RCA 的效率可达到l05 倍，而指数RCA 的效率可达到109 倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单拷贝水平[3]；(2)高序列特异性。可以区分单一位点的不合模式；(3) 扩增产品经过磷酸化处理后可以直接用来测序。(4)高通量。RCA 可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA 产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增；RCA 只要包管探针的识别段序列与靶序列互补，不需要考虑靶序列的性质，因此检测RNA 时不再需要预先进行RNA 的逆转录。 RCA 的缺乏：（1）锁式探针常接近100bp，合成用度较高。2000 年，Antson DO 等采取PCR 办法在实验室合成探针，可以在很年夜水平上降低本钱；（2）信号检测时的布景问题。在RCA 反响过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA 或者RNA 可能产生一些布景信号。
1. 3 滚环核酸扩增在畜牧生产中的应用
虽然可以通过一些办法部分克服RCA 的缺乏，但也进一步增加了反响本钱，使得RCA 在植物疾病的临床检测中不适合被采取。 2 环介导等温扩增
2. 1 环介导等温扩增的原理
环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA 在65℃左右处于静态平衡状态，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，酿成单链，在此前提下利用4 种不合的特异性引物识别靶基因的6 个特定区域，在链置换型DNA 聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA 互补序列配对，启动链置换DNA合成[4]。 2. 2 环介导等温扩增的优势与缺乏
LAMP 的优势：（1）扩增效率高，能够在1h 内有效的扩增
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110 个拷贝的目的基因，扩增效率为普通PCR的10 倍100 倍；（2）反响时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
LAMP 的缺乏：（1）对引物的要求特别高；（2）扩增产品不克不及用于克隆 测序，只能用于判断；（3）由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。
2. 3 环介导等温扩增技术在植物疾病检测中的应用
LAMP 技术从出生之日起就被认为是最有可能取代PCR 进行实验室检测的办法。 年AnneLie B 等应用RTLAMP建立了猪水疱病病毒(SVDV)的诊断办法[5]，该办法对血清样本的敏感性相当于实时PCR，对粪便样品的敏感性优于实时PCR。 3链置换扩增
3. 1 链置换扩增的原理
链置换扩增其原理是基于在靶DNA 两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA 掀开缺口，DNA 聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA 链[6]。被替换下来的DNA 单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不竭频频进行，使靶序列被高效扩增。SDA 的基本系统包含一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA 聚合酶、两对引物、dNTP 以及钙、镁离子和缓冲系统。 3. 2 链置换扩增技术的优势与缺乏
SDA 的优点：（1）扩增效率高，据Walker 等人的报导，采取SDA 扩增结核分枝杆菌总DNA 中的一段序列时，37℃反响2 小时后，可将靶序列扩增106 倍[7]；（2）反响时间短，特异性强，不需要特殊的设备。
SDA 的缺乏：（1）SDA 产品不均一。在SDA 循环中总要产生一些单、双链产品，用电泳法检测时必定要呈现拖尾现象。（2）SDA 产品不成能直接用于克隆，测序和表达。使得SDA 在基因工程方面没有优势；（3）SDA 产品的检测手段有待提高。目前SDA 产品检测的主导办法是荧光偏振检测，但该检测办法需要特殊的检测仪器 荧光分光光度计，这限制了SDA 在临床的广泛应用。
3. 2 链置换扩增在植物疫病检测中的应用
以后SDA 办法主要应用于分枝杆菌核酸定性检测、病毒体
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恒温扩增技术综述之欧阳育创编
