CRISPR基因编辑基因型鉴定方法

CRISPR基因编辑基因型鉴定方法

CRISPR 组分导入细胞 / 动物后，要确定细胞 / 动物的基因编辑效果，需要对细胞 / 动物进行基因型鉴定（genotyping），整个过程包括提取细胞 / 组织基因组，含靶点基因组片段的 PCR，T7E1突变检测，测序，TIDE 分析等。确定细胞 / 动物基因突变效率及突变情况。

基因型鉴定主要分为四种类型，第一种类型单 gRNA Cas9（NHEJ修复）造成的Indel突变，检测办法是提取细胞/组织基因组，PCR，T7E1 突变检测，测序，TIDE 分析。由于单 gRNA Cas9 造成的基因突变都是小片段的插入或缺失（一般都在 20 bp 以内），通过 PCR 无法判断基因是否发生突变，利用 T7E1 可对不完全匹配 DNA 进行切割的特点，将 PCR 产物完全变性后复性，如果 PCR产物靶点处发生 Indel 突变，就会形成两侧匹配，靶点处不匹配的DNA 结构，T7E1 会识别不匹配位点并切断 DNA。通过切割条带与未切割条带光密度对比计算突变效率，PCR 产物测序结果显示在靶点处出现大量双峰，通过专用软件 TIDE 可分析 Indel 突变类型及突变效率。

第二种类型是双 gRNA Cas9 造成的基因片段缺失，检测方法是先提取

基因编辑细胞基因组，通过靶点两侧设计的引物 PCR 扩增得到野生型条带及突变型条带（突变型条带较野生型条带少一段缺失序列，所以条带比野生型条带小），PCR 产物跑胶即可大致判断敲除效率，进一步通过测序确定缺失突变情况

第三种类型是基因敲入，修复，修饰，主要检测基因发生同源重组的情

况，一般一条检测引物设计在同源臂以外，一条引物设计在同源臂内，分别检测5‘端和3’端重组情况，结合PCR产物测序，可确定同源重组及其效率。

第四种类型是点突变，点突变相对野生型来说只发生了一个碱

基的改变，检测办法是提取细胞/组织基因组，PCR，T7E1突变检测， 测序，分析突变位点处是否出现双峰（测序确定靶位点是否发生需 要的点突变）。

基因型检测一般是在 CRISPR 组份导入细胞后 48~72 小时，取

部分细胞，进行基因型检测，确定基因编辑效率较高后，对细胞进行有限稀释，稀释到 96 孔板中培养，每孔取部分细胞进行基因型检测，筛选得到纯合基因编辑的细胞。

动物基因编辑以小鼠为例，原核注射受精卵后，胚胎培养 16 小

时后，移植到假孕小鼠输卵管中，待小鼠出生后（F0），取鼠尾或脚趾进行基因型检测，检测到符合要求的基因型后，待小鼠成年与野生型小鼠进行交配，对子代（F1）进行基因型检测，将 F1 同窝基因编辑杂合（基因型相同）小鼠交配后，可得到基因编辑纯合小鼠（F2）。