木犀草素对人肝癌HepG2细胞株侵袭、迁移和黏附能力的
影响*
李春雨1△， 王 琪2， 申 珅1， 李国霞1
【摘 要】[摘 要] 目的： 探讨木犀草素对人肝癌HepG2细胞株侵袭、迁移和黏附能力的影响及其作用机制。方法: 采用不同浓度木犀草素处理体外培养的人肝癌HepG2细胞株，Transwell实验检测细胞的侵袭能力，划痕实验检测细胞的迁移能力，黏附实验评价细胞的黏附能力，Western blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1蛋白的表达。结果: 木犀草素可明显降低肝癌HepG2细胞的体外侵袭、迁移及黏附能力(P<0.01)，且在一定浓度范围内呈明显量效关系。木犀草素处理肝癌细胞后，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达明显上调，间质细胞标志蛋白N-cadherin和vimentin以及转录因子Snai1表达均明显下调，木犀草素对以上蛋白的调节呈明显浓度依赖性。结论: 木犀草素体外具有抑制肝癌HepG2细胞株侵袭、迁移和黏附的作用，其作用机制可能与调控上皮-间质转化有关。 【期刊名称】中国病理生理杂志 【年(卷),期】2017(033)009 【总页数】5
【关键词】[关键词] 木犀草素； 肝细胞肝癌； 细胞侵袭； 细胞迁移； 细胞黏附； 上皮-间质转化 [
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，居全球恶性肿瘤发病率第5位，死亡率第3位[1]。我国是肝癌大国，全世界一半以上的肝癌发生在我国，且发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类生命健康[2]。肿瘤细胞转
移是导致HCC患者不能长期生存和临床治疗失败的主要原因[3]，因此研发低毒、高效的抗肝癌转移药物迫在眉睫。木犀草素(luteolin)是一种天然的多酚类黄酮化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[4]。研究报道，木犀草素对乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用[5-6]。但关于木犀草素对肝癌细胞侵袭、迁移及黏附的作用研究较少，本文就此开展研究，探讨木犀草素对肝癌细胞侵袭、迁移和黏附的及作用机制，以期为新药开发提供科学依据。
材料和方法
1 材料及仪器
CO2培养箱(SANYO)；IX71型倒置显微镜(OLYMPUS)；G:BOX F3凝胶成像系统(Syngene)；HepG2细胞来源于ATCC，由本实验室保存；木犀草素购自方舟生物试剂有限公司(纯度≥98%)；Matrigel基质胶(BD)；纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)购自Sigma；抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和Snai1抗体购自Abcam；全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、Western blot检测试剂盒、ECL化学发光底物等购自南京凯基生物科技发展有限公司。 2 方法
2.1 Transwell实验检测HepG2细胞的侵袭能力 Matrigel用PBS稀释成1 g/L，以每孔50 μL铺于Transwell小室聚碳酸酯膜，Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(每孔600 μL)，上室加入HepG2细胞，细胞浓度为5×108/L，每孔50 μL；实验设木犀草素低、中、高剂量组及对照
(control)组，分组后分别加入不同浓度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO对细胞进行处理，37 ℃孵育24 h后，弃上室液体，棉签擦去上膜未穿膜细胞，苏木精染色，倒置显微镜计数穿膜细胞数，每张膜随机选取3个视野，分析细胞侵袭能力变化。
2.2 划痕实验检测HepG2细胞的迁移能力 取对数生长期HepG2细胞，调整细胞浓度至5×108/L，铺于35 mm培养皿培养24 h，设木犀草素低、中、高剂量及DMSO对照(control)组，分组后加入不同浓度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO进行处理，24 h后用10 μL枪头在培养皿底部中央划出均匀划痕，换液后继续培养24 h，于不同时间(0、3、6、9、12、24 h)在倒置显微镜下拍照，记录划痕宽度变化，分析细胞迁移能力变化。
2.3 黏附实验检测HepG2细胞的黏附能力 盖玻片用10 mg/L FN包被，4 ℃过夜，风干后置于35 mm培养皿中；取对数生长期HepG2细胞，调整细胞浓度至3×108/L，加入35 mm培养皿中(每皿1.5 mL)，设木犀草素低、中、高剂量及对照(control)组，加入不同浓度(10、20、40 μmol/L)木犀草素及DMSO处理，37 ℃孵育24 h后，加入表皮细胞生长因子(10 μg/L，每皿200 μL)或无血清培养基后，分别在5、15、30 min时，使用冰PBS清洗终止反应，4%多聚甲醛固定细胞，倒置显微镜计数每个培养皿的细胞黏附数，随机选取5个视野，分析细胞黏附能力变化。
2.4 Western blot 检测E-cadherin、N-cadherin、vi-mentin和Snai1蛋白的表达 采用TGF-β1(20 μg/L)诱导HepG2细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，胰酶消化收集经不同浓度的(10、20、40 μmol/L)木犀草素和TGF-β1处理48 h的细胞，SDS细胞裂解液提取
木犀草素对人肝癌HepG2细胞株侵袭、迁移和黏附能力的影响
