常用的半抗原与蛋白偶
联方法简介
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常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
(一)分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联)
1、混合酸酐法,也称氯甲酸异丁酯法(isobutyl chloroformate method) 偶联时,半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤(MIT)与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
1、5.8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解,冷却至10度,加2ul氯甲酸异丁酯,10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时(必要时加NaOH,以维持溶液的pH为,q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱,柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱,合并含酶的洗脱管内液体,进一步纯化后,保存于含BSA %(w/v)、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解(I液)
2、??取3,3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS ()液中(III液)
4、??将II液与III液混合,在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下) 5、??室温下避光搅拌1小时,逐滴加入余下的I液 6、??4度搅拌12小时 7、??静置10小时(4度)
8、??有蒸馏水使之充分透析(约48小时),得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯,配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC(二环已基碳化二亚胺),200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿:水=9:1)
4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例,将上述溶液加入到酶液(用,浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解)中。 5、??
(二)含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
1、??用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。
2、??滴加1%NaNO2(过量),4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1%淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘,碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、??溶液变成蓝黑色后,继续反应15分钟。
4、??用、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、??边搅拌,边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象),调节pH到。
6、??冰箱中搅拌反应2小时,不断调节pH到。 7、??用PBS透析2天
8、??-20度保存(浓度为20mg/mL)
双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应,形成脒。例如:用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
应用双功能酰亚胺酯(imidate esters)制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤
1、??用含5%(W/V)N-乙基吗啉的无水甲醇,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)
2、??取与β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于的100 m mol/L碳酸缓冲液(含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇 10 m mol/L (B液)
3、??将A液倒入B液。
4、??20度反应90分钟后,加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇 10 m mol/L、的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
5、??过sephadex G-25, 去除小分子物质,得酶标记物(约75%的酶与半抗原结合,但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联,则只有15%的酶与之结合。
(三)含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外,将载体蛋白用溴乙酰胺
(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中,通过过氧化氢的作用形成二硫键,也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
(四)含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤
1、??15g 2,2,2-三氯乙醇(2,2,2-trichloroethanol),12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、??加热回流1小时。
3、??减压蒸馏去溶剂,,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。 4、??用乙醚洗涤两次,然后用H2SO4进行s酸化(pH到).
5、??用水洗涤固形物(为三氯乙基半琥珀酸酯)两次,用氯仿-已烷使其结晶(产量约75%,熔点88-89度)
6、??取 半琥珀酸酯溶于 亚硫酰氯(thionyl chloride)中,65度加热30分钟。
7、??减压蒸发,干燥1小时(高度真空条件下)。
8、??将上述产生(2,2,2-三氯忆基琥珀酰氯)溶于15ml N,N-二甲基-
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
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