西北大学硕士毕业论文１．４．３．２纤维素酶活的测定将初筛得到的菌株接种到固体产酶培养基中，置于３０＂Ｃ恒温培养，制备粗酶液，测定酶活。１．５粗酶液的制备将湿曲在３０＂Ｃ下烘干，称取干曲１９，加蒸馏水２０ｍＬ，搅拌均匀，于３０＂Ｃ恒温水浴１ｈ，用两层纱布挤滤，滤液离一１二，（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃），上清液即为粗酶液（徐昶等，２００５）。１．６纤维素酶活测定方法１．６．１羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）活力取２ｍＬ羧甲基纤维素溶液于试管中，加Ｏ．５ｍＬ稀释的粗酶液，混匀后，于５０＂Ｃ水浴３０ｍｉｎ。以每３０ｍｉｎ产生ｌｍｇ还原糖定义为１个酶活力单位（Ｕ）。１．６．２滤纸酶（ＦＰＡ）活力取０．５ｍＬ稀释的粗酶液，加２ｍＬ醋酸缓冲液和１条滤纸（新华１号，ｌｅｍ×６ｃｍ）于带塞试管中，５０＂Ｃ水浴１ｈ。以每小时产生ｌｍｇ还原糖定义为１个酶活力单位㈣。以在１００。Ｃ水浴灭活５ｍｉｎ的粗酶液为对比液，其余步骤相同。酶活力均指扣除对比液中还原糖后计算得到的结果（齐义鹏，１９９０；Ｍａｎｄｅｌｓ１９７６；张树政，１９８４）。ａｎｄＡｎｄｒｅｏｔｔｉ，１．７菌种鉴定参考《真菌鉴定手册》（魏景超，１９７９）和《常见与常用真菌》（中科院微生物所，１９７８）进行菌落形态和显微形态观察。１．８菌种复配比例的确定１．８．１菌种培养将筛选的真菌与实验室保藏的细菌一枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）在相应的培养基上扩大培养，具体步骤：①用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；②接种斜面培养物于种子瓶，西北大学硕士毕业论文细菌在３０。Ｃ，１８０ｒｐｍ培养１２ｈ得到种子液，霉菌在２８＊（２，２２０ｒｐｍ培养４８ｈ得到种子液；③１０％的种子液接种到发酵瓶中扩大培养４８ｈ得到发酵液。将发酵液与灭菌麸皮以１：１的比例混合发酵２４ｈ．７２ｈ后晾干，制成固体菌剂。１．８．２菌种复配通过堆肥试验确定菌种的最佳复配比例：将固体菌剂以不同的比例混合组成复合微生物菌剂，以３％ｏ的总接种量接入到堆肥中，观察不同比例的实验处理对堆肥升温速度、堆肥最高温度及高温保持时间的影响，选择最佳菌种比例。同时以不加复合菌剂的处理为对照。１．８．３堆肥条件此试验的堆肥条件：堆肥物料的总质量为５００ｋｇ，其中牛粪与稻壳粉的比例为３０：９（以干物质计），Ｃ／Ｎ为３０：１，含水率７０％，２ｄ翻堆一次，堆肥２０ｄ。试验过程中，环境温度在２５℃左右。１．８．４温度测定方法由玻璃温度计检测，测堆肥堆体四角３０—５０ｃｍ处及堆体中央共五处温度值，求和算平均值。２结果与分析２．１菌种筛选２．１．１初筛结果通过刚果红平板分离筛选，得到透明圈／菌落直径比值较大且生长较快的５个菌落。将所得的５株真菌分别进行划线分离、编号并保藏于固体斜面培养基上。２．１．２复筛结果２．１．２．１初筛菌株的生长曲线２１西ｊ匕犬学硕士毕业论文毒２Ｏ鑫ｅ≮一榭＿圭剐捆４２ＯＵ１Ｚ罩４毒睁，０■时间（ｄ）图２－Ｉ初筛菌株的生长曲线Ｆｉｇ。２－１Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｌｌｒｖｅｏｆｓｔｒａｉｎｓｓｃｒｅｅｎｅｄ由图２．１可知，初筛的５株真菌的生长速率为Ｍ．４＞Ｍ．》Ｍ．３＞Ｍ．Ｉ＞Ｍ．５。２。１．２．１纤维素酶活测定结果将初筛所彳导的菌株在基础固体产酶培养基上发酵，然后测纤维素酶活力，重复３次取平均值，试验结果如表２．２。表２．２不同菌株酶活力比较Ｔａｂ．２—２Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｔｒａｉｎｓ注：Ｕ／ｇ中的质量指干曲。由表２－２可知，菌株Ｍ．２的ＣＭＣ酶活和ＦＰＡ酶活最高，其次是Ｍ－１和Ｍ．４菌株。综合菌株的生长速率和酶活，选用Ｍ．２和Ｍ．４两株菌做进一步盼研究。２．２菌株鉴定结果２。２。１Ｍ－２菌株鉴定结果ＰＤＡ平板菌落特征：菌落在ＰＤＡ平板上生长快，最初为白色致密的基质菌丝，然后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢区。显微镜观察结果：分生孢子梗呈环状排列，有隔膜，垂直对生分枝，分生孢子绿色至暗绿色，球形至卵形，孢壁粗糙，直径为３．６８．３．９３微米，常在孢子梗西北大学硕士毕业论文顶端聚集成团状。初步鉴定该菌株为绿色木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ２。２。２ｖｉｒｉｄｅ）。Ｍ．４菌株鉴定结果ＰＤＡ平板菌落特征：菌落生长迅速，初呈黄色或淡黄绿色，后变为黄褐色。显微镜观察结栗：分生孢予梗细长，有隔膜，头部呈放射形，分生孢子黄绿色，梨形，孢壁粗糙，直径为５—８微米。初步鉴定该菌株为米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）。２．３菌种复配比例的确定本文选用物料升温速度快，最高温度高，且高温维持时间长的处理为菌种复配的最佳比例。通常堆肥温度高于５０℃称为高温阶段，而对于多数致病菌和寄生虫卵，在５５℃以上的高温杀灭效果较好（李国学和张福锁，２０００；彭光明和裴保义，１９７９）。因此本文所指高温阶段郎５５℃以上。表２．３微生物菌剂接种方案Ｔａｂ．２．３Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｃｈｅｍｅｏｆｅｆｆｅｃｔｕａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ注：表孛阿拉伯数Ｏｔ２３４§ｅ７８９’Ｏ＂＇１２１３１４１５１６１＂Ｉ’８１９２０２１笠对阕《彭图２－２复合菌剂菌种比例对发酵温度变化的影响Ｆｉｇ．２－２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｓｏｆｓｔｒａｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ西北大学硕士毕业论文表２菇复合菌剂毽耪比例对发酵瀑度变他的影噙Ｔａｂ．２．４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｓｏｆｓｔｒａｉｎｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ由图２－２和表２罐可知，各处理的物料舞温速度均大于对照井温速度，最高温度高于对照组。发酵中升温最快的、温度最高的均为处理１菌种组合，温度升高到５５℃仅用６天，高温维持８ｄ，最高温度为“℃。其次为处理３。由表２可知，处理ｌ和处理３的霉菌含量襄显高于其他处理。分析其原因，认力是虞子当复合微生物菌剂接入物料中，由于物料环境复杂，可以直接供给细菌生长繁殖的营养物质少，不适合细菌的大量繁殖。而霉菌能释放出大量的胞外纤维素酶和糖化酶，可以快速分解纤维素和淀粉等物质，进焉细菌利用霉菌的分解产物开始大量繁殖，同时枯草芽孢杆菌产生胞外蛋白酶，假单胞菌产生胞外脂肪酶加速物料中有机质的分解，霉菌和细菌二者互相促进，协同作用，加快物料腐熟速度。综合考虑，选择处理ｌ为复合微生物甍剂的最佳比例，即绿色本霉：米盐霉：枯草芽孢杆菌：假单胞菌一２：２：１：１。３本章小结微生物是发酵过程中最关键的因素，对发酵过程的控制，实际上就是对发酵物料中微生物的控制。由于堆肥原料的成分复杂，含有纤维素、碳水化合物和脂肪等多种化合物，要使它们较彻底的降解，需要多种微生物的相互交替和协同作用，因此，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快发酵进程中作用都比不上多种微生物的共同作用（ＸｉＡａａｍｕｔｈｕｅｔＢｅｉｄｏｕａｎｄＬｉｕＨｏｎｇ－Ｌｉａｎｇ，２００２；ａ１．，２００１；Ｓｈｉｎ，１９９９）。蔼自然堆肥由于所含微生物的种类和数量有限，因此发酵周期长，效果差。向堆料中接种复合微生物菌剂，能够增加堆层２４
牛粪发酵生产生物有机肥的工艺优化及应用研究 - 图文
