血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成
苏慧慧1，万春友2，魏蔚3，孟海妹1，焦亚冲1，邢冬红1，郑芳1△
【摘 要】摘要：目的 探究血清淀粉样蛋白A（SAA）能否在体外诱导中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。方法 建立稳定的体外诱导NETs形成方法，包括外周血中性粒细胞的分离、细胞体外培养、NETs的诱导和形态学观察。提取健康志愿者的外周血中性粒细胞，分为阴性对照（NC）组、SAA组和脂多糖（LPS）组，给予相应的刺激后，观察NETs的形成并计算百分率，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中人组蛋白3（h3）的含量。结果 提取的外周血中性粒细胞纯度与细胞活力均在95%以上。显微镜下观察到部分细胞的细胞核失去原有核型，向外扩散形成网状，即NETs。与NC组相比，接受SAA刺激的中性粒细胞有更多的NETs形成（P < 0.05）。培养液上清中的h3含量显著高于NC组（P < 0.05）。结论 SAA可在体外诱导中性粒细胞形成NETs。
【期刊名称】天津医药 【年(卷),期】2016(044)002 【总页数】3
【关键词】血清淀粉样蛋白A；中性粒细胞胞外诱捕网；中性粒细胞；炎症；人组蛋白3
△通讯作者 E-mail：zhengfang@tijmu.edu.cn
中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒细胞受到相应刺激时形成的以DNA为骨架，颗粒蛋白等黏附其上的网状结构[1]。NETs形成后可限制感染的扩散，有免疫防御的功能[1]。此外，NETs还参与炎
症过程和一些自身免疫病的发生与发展[2]。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一种主要的急性时相反应蛋白，在一些炎症性疾病中表达水平可大幅度升高。SAA作用于中性粒细胞，可趋化其向炎症部位聚集，并诱导中性粒细胞表达多种细胞因子[3]。但SAA与中性粒细胞形成NETs这一过程的关系目前尚鲜见报道。本研究旨在探究SAA是否能够诱发中性粒细胞形成NETs这一过程。
1 材料与方法
1.1 材料 Histopaque- 1119、Histopaque- 1077、脂多糖（LPS）均购于Sigma-Aldrich（德国）公司。重组人Apo-SAA购于peprotech（美国）公司。人组蛋白3（histone 3，h3）酶联免疫试剂盒购于鑫乐（中国，上海）公司。无酚红1640购于康宁公司。DAPI染料、红细胞裂解液购于solarbio（中国）公司。 1.2 方法
1.2.1 中性粒细胞的分离 选取4名2015年3—4月到天津医科大学总医院进行健康体检的健康志愿者，清晨空腹采集静脉血，EDTA抗凝，按如下步骤分离中性粒细胞。EDTA抗凝全血、Histopaque-1119、Histopaque-1077按2∶1∶1的比例加入离心管。首先加入3 mL Histopaque-1119，再将3 mL Histopaque-1077加于其上避免晃动，然后加入EDTA抗凝全血6 mL。700×g离心30 min低速制动。离心后His?topaque-1119及Histopaque-1077之间的细胞层为中性粒细胞。收集中性粒细胞，加入红细胞裂解液1 mL，室温裂解2 min，450×g离心3 min，加入PBS重悬，450×g离心3 min，如此洗2遍。加入无血清无酚红的1640培养基重悬细胞，计数并将细胞稀释
至所需密度备用。4 g/L台盼蓝染色后观察细胞活力。HE染色观察（×400），随机取10个视野并分类计数视野中全部细胞，计算中性粒细胞百分率。DAPI染色观察细胞核形态。
1.2.2 NETs的诱导 提取中性粒细胞，血细胞计数板计数细胞个数。将细胞密度调至1.5×105个/孔，接种于铺有盖玻片的24孔板，置于含有5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养30 min。实验分为3组：SAA组加入SAA，终浓度为25 mg/L（基于之前预实验的结果）；阴性对照（NC）组加入等体积的Tris-HCL缓冲液作溶剂对照；LPS组加入LPS，终浓度为1 mg/L。每组样本各设3个复孔。4 h后收集上清，350×g离心5 min，留取上清，存于-20℃备用。孔中加入4%多聚甲醛固定细胞爬片10 min，用于后续研究。
1.2.3 NETs的观察与评估 细胞爬片固定后，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后0.05% trition通透1 min，0.5 mg/L DAPI染液避光染色5 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，甘油与水1∶1比例配置的封片液封片，荧光显微镜观察。每个细胞爬片随机计数10个视野中的NETs数和细胞总数，计算NETs形成百分率。
1.2.4 细胞培养液上清中h3含量的检测 将样本用稀释液稀释4倍后，按说明书上标明的程序，采用ELISA法检测细胞培养液上清中h3含量。
1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析数据，作图采用GraphPad Prism 5软件，计量资料采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 中性粒细胞的提取 镜下可见中性粒细胞占所提取细胞总数的95%以上，
血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成
