实验六、植物组织丙二醛含量测定
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白 质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这 些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物 在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于 活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用， 造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含 氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产 生的活性氧主要有超氧自由基(0-2)、羟自由基(0H ?)、过氧自由基 (R00?)、烷氧自由基(RO?)、过氧化氢(H2O2、单线态氧(021)等。 植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶 POD和抗坏血酸过氧化物酶 (ASA-POD等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型 谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加 剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程 度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生 理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 [ 原理 ]
植物组织中的丙二醛 (MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸 (TBA) 产生显色反应， 反应产物为粉红色的 3， 5， 5 一三甲基恶唑
2， 4 一二酮(Trimet — nine)。该物质在539nm波长下有吸收峰。由于硫 代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代 巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定 600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二 醛的含量。
［材料、仪器、药品］
1 .材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品， 即绿色和黄色
叶片的高温处理和室温对照。 2 (5)
.仪器：(1)分光光度计；(2)离心机；(3)水浴锅：(4)天平； 研钵；(6)剪刀；⑺5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml); (10)镊
子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml) ； (12)冰箱。
3. 药品：
(1) 0.05mol∕L pH7.8 磷酸钠缓冲液； (2) 石英砂； (3) 5%三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解， 然后定容到100ml；
⑷0.5 %硫代巴比妥酸溶液：称取 0.5g硫代巴比妥酸，用5% 三氯乙
酸溶解，定容至100ml,即为0.5 %硫代巴比妥酸的5%三氯乙 酸溶液。 ［方法］
1.丙二醛的提取:取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol∕L pH7.8 的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆， 转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管 中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转∕min离心10min。上清液即 为丙二醛提取液。
2 .丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中，加入0.5 % 硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加热10min,迅速 冷却。于4500转∕min离心10min。取上清液于532、600nm波长下， 以蒸馏水为空白调透光率100%测定吸光度。 3 .结果计算：
(A532—A600) ×V1×V
丙二醛含量(nmol/g ) = 1.55 × 10-1 × W× V2
式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1); V为提取液总量(5ml); V2为反应液中的提取液数量
(2ml) ; W为植物样品重量(0.5g);
1.55 × 10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数(在1升溶液中含有1 μmol丙 二醛时的吸光度)。 4. 注意事项：
(1) 0.1~0.5 %的三氯乙酸对 MD— TBA反应较合适，若高于此浓度， 其反应液的非专一性吸收偏高；
(2) MD— TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。
时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；
(3) 如用MDA乍为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否 能与TBA反应形成532nm处的吸收峰。否则只测定532、600nm两处A 值，计算结果与实际情况不符，测得的高 A值是一个假象； (4) 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再 是由于脂质过氧化产物 MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增 加，由此改变了提取液成分，不能再用 532nm 600nm两处A值计算 MDA含量，可测定 510、532、560nm处的 A值，用 A532一（A510—A560）∕2 的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。 [ 实验结果记录 ] [ 实验前思考题 ]
（1） 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？
（2） 什么时候植物会发生严重的膜脂过氧化作用？简述其过氧化作用 过程。
（3） 说明膜脂过氧化作用的对植物的效应。 （4） TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？
（5） 提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过 长？
（6） 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？
（7） 在计算公式中， 为什么吸光系数的单位是微摩尔， 而最后的含量
单位却是毫微摩尔？
（ 8）写出实验时间按排和操作流程图。
（9）写出抗逆性鉴定和丙二醛含量测定实验统一的时间按排和操作流 程图。
[ 实验后思考题 ]
（1）如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定， 你有什么办法消除其 影响？
2）丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？
丙二醛含量测定.docx
