第一部分：基本理论 抗原的两种特性：免疫原性、免疫反应性 共同抗原、交叉反应、异嗜性抗原、超抗原等 抗原的分类依据性能：完全抗原、不完全抗原 依据抗体产生是否要T cell刺激：胸腺依赖性抗原（TD-Ag）、
抗原 胸腺非依赖性抗原（TI-Ag） 刀豆蛋白A（ConA） 丝裂原 植物凝集素 美洲商陆丝裂原 脂多糖（LPS） 葡萄球菌A蛋白（SPA） 结构与功能：略 IgG 抗原抗体反应 抗体 IgM IgA IgD IgE 抗原抗体反应原理 抗原抗体反应特点 单体分子、血清和细胞外液中含量最高 五聚体、分子量最大、不能透过胎盘、宫内感染指标 有两种类型（血清型和分泌型）、对新生儿早期抗感染十分重要 单体分子、膜结合型IgD是Bcell分化成熟的标志 单体分子、含量最少、特异性过敏和寄生虫感染中有意义 结合力、亲和力与亲合力 ①特异性；②比例问题：等价带、前带、后带；③可逆性 抗原 影响因素 反应物 反应条件 抗体 理化性质、抗原表位等 来源：R型血清和H型血清 特异性与亲和力 T细胞有丝分裂原 T细胞有丝分裂原 T细胞和B细胞有丝分裂原 B细胞有丝分裂原 B细胞有丝分裂原 电解质、酸碱度、温度、比例 粗抗原制备：捣碎组织、破碎细胞、粗提取 分离与纯化、浓缩与保存 将半抗原与载体结合，常用蛋白质作为载体 合成肽属于半抗原的一种，所以·· 颗粒性免疫原的制备 较简单、分离或纯培养 可溶性抗原的制备 免疫原的制备 人工免疫原的制备 合成肽抗原的制备 基因工程抗原的制备 获得目的抗原的基因编码，然后扩增纯化 使用免疫原免疫动物获得抗体、又叫抗血清； 抗原抗体的制备 多克隆抗体制备 弗氏完全佐剂（CFA，石蜡油+羊毛脂+卡介苗）和弗氏不完全佐剂（IFA，石蜡油+羊毛脂） 大致过程：获取、鉴定、纯化、保存 抗体的制备 单克隆抗体原理：杂交瘤技术等 亲本细胞的选择与融合：无菌取脾 HAT培养基的选择作用 制备单克隆抗体：在小鼠腹腔诱生出肿瘤并产生含McAb的腹水 （McAb）制备 阳性克隆选择与克隆化 鉴定、保存、应用 基因工程抗体的制备 差速离心 粗分离；会有共沉；分离分子量相差大的物质；动力学方法 用于分离密度相近大小不同；常用介质为蔗糖、甘离心分离 密度梯度离心 油；离心分离的物质密度一定要大于密度梯度介质的最大密度；有共沉 等密度梯度 盐析法 沉淀分离 有机溶剂沉淀 非离子聚合物沉淀 抗原抗体的纯化 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 常用凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Superdex 利用欲分离物质和它们的特异性配体间具有特异性亲和力 纸电泳 醋酸纤维薄膜 有支持体 薄层电泳（薄膜或薄板） 非凝胶性支持体区带电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶等） 电泳 凝胶支持体区带电泳（淀粉液、聚丙烯酰胺凝胶） Tiselius移界电泳 显微电泳 无支持体 等点聚焦电泳 等速电泳 密度梯度电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区别 分离大小相同密度不同的物质；介质常用铯盐；铯盐对铝有腐蚀，防止溅出；不会有共沉 原理：盐的存在减弱了蛋白分子周围的水化膜，导致蛋白发生聚集而沉降 优：分辨率高、溶剂易除；缺：有毒、可能会是蛋白失活 常用聚乙二醇 第二部分：免疫检验技术 液相沉淀试验 1. 沉淀反应 ①可溶性抗原；②多克隆抗体更适合；③R型血清首选 免疫浊度测定（定量） 免疫电泳 凝胶沉淀试验 环状沉淀试验：定性 絮状沉淀试验 单向扩散试验 双向免疫扩散试验(定性) 对流免疫CIEP 火箭电泳 免疫电泳 免疫速率抑制浊度测定 抗体稀释法、棋盘格法（找出Ag、Ab最佳比例） 定量试验；两个曲线 沉淀线数目：抗原或抗体不纯；沉淀线弯向分子量大的；沉淀线靠近浓度低的；可以测定效价(半定量) 双扩+电泳；Ag向正极泳动、Ab向负极泳动 单扩+电泳；定量 先蛋白区带电泳、再双扩 用一定量的已知半抗原-载体与限量特异性抗体反应，测定生成的半抗原-载体-抗体所造成的散色速率 透射浊度测定、散射浊度测定 直接凝集试验 间接凝集试验 ①将抗原与某一载体结合；②常2. 凝集反应 ①颗粒性抗原或带有可溶性抗原的载体 ②定性试验 其它凝集试验 用载体：人O型RBC、SRBC、SPA等 玻片凝集 试管凝集 定性；多用于红细胞ABO血型 半定量、多用于Ab；外斐试验、肥达试验 正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 用抗原致敏颗粒检测抗体 用已知抗体检测抗原 间接凝集试验 间接凝集抑制试验 间接血凝试验 抗球蛋白试验（Coombs试验） 协同凝集试验 冷凝集试验 自身红细胞凝集试验 用已知抗原致敏颗粒和相应抗体，检测样本中是否有与致敏颗粒相同的抗原，有正向和反向 载体颗粒为红细胞 是抗球蛋白参与的间接血凝试验 直接Coombs 间接Coombs 检测已粘附在RBC的不完全抗体；新生儿溶血、自身免疫溶血性贫血 血清中游离抗体；多用于检测母体Rh(D) 载体颗粒为SPA的间接凝集试验 检测冷凝集素的方法，0~4℃最明显 主要试剂为抗人O型红细胞MCAb，可以与各型RBC结合却不引起凝集；样本为全血 特点是排除由于红细胞凝集可能引起的假阳性 活化经典途径；为么要50%溶血作为终点测定；意义 EGTA螯合Ca2+，封闭Cl，阻断经典途径 3. 补体试验 系统：①缓冲液PBS②补体③SRBC④溶血素 补体结合试验 固相载体 酶和底物 4. 酶免疫技术(E) 定量或定性 分类 补体测定试验 血清总补体活性(CH50)测定 旁路活化途径(AP-H50)测定 分为直接(不溶血为阳性)和间接(溶血为阳性)两类 实验结果要对照众多对照实验观察 最常用聚苯乙烯 最常用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)；还有β-半乳糖胺酶 双抗体(原)夹心 双位点一步法 间接法 竞争法 检测抗原最常用；只适用于二价或二价以上大分子抗原 双抗夹心时，待测样品和酶标物一起加入 检测抗体最常用 既可测抗原，又可测抗体；参考管和待测管对照观察 最常用、最广泛；黄色或橙黄色粉末；激发后发出黄绿色 橘红色粉末；激发后为橘红色荧光 5. 荧光免疫技术(F) *阳性细胞数量和荧光强度可以作为定量或半定量指标 常用荧光物质 异硫氰酸荧光素(FITC) 四乙基罗丹明(RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) 藻蛋白类 紫红色粉末，激发后有橙红色荧光；猝灭速度慢 藻红蛋白PE(此类最常用)、藻青蛋白PC、别藻青蛋白APC；多呈现橙色或红色物质 光源 荧光显微技术 滤板 光路 直接染色法 间接染色法 分类 补体结合免疫荧光 双标记染色 流式荧光免疫技术 放射免疫分析(RIA) 6. 放射免疫技术(R) *精确测定各种微量物质 免疫放射分析(IMRA) 分类 短波光；波长连续或不连续； 隔热滤板、激发滤板、吸收滤板； 透射光或落射光 荧光标记抗原(抗体)直接检测抗体(抗原) 酶联免疫+荧光标记 Ag,Ab结合激活补体；荧光素标记抗补体的抗体； 标记不同抗体检测同一样品 定量分析或纯化；流式细胞仪与荧光免疫结合 原理：标记抗原(可以为半抗原)Ab*和非标记抗原Ab对特异性抗体Ag(一定量)的竞争结合反应 计数仪 原理 γ射(131I,125I)线用晶体闪烁计数仪 β射线(57Cr,60Co)用液体闪烁计数仪 以过量标记的抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应，时间段，灵敏度较RIA高，操作较简单 单位点IRMA 双位点IRMA 间接IRMA 直接用放射标记物质检测另一个 同时与待测抗原的两个抗原位点结合；灵敏度高 双抗夹心结合间接法再结合IRMA RIA与IRMA的比较 P169 胶体特性 胶体金特性 呈色性和光吸收 7. 金免疫技术 快速诊断 分类 斑点金免疫层析试验 发光原理 化学发光 8. 化学发光免疫分析技术 高灵敏高特异性 发光标记物 斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)（可以定性） 电解质可以使之水化膜破坏而聚集沉淀 颗粒直径5~20nm：葡萄酒红色；颗粒直径20~40nm：深红色；颗粒直径60nm：蓝紫色等 将特异性抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上，其下面有吸水材料，形成渗滤装置；阳性有红色出现 有间接法和双抗夹心法 双抗夹心法 竞争法 较大分子抗原；质控线红色且T区显红为阳性 小分子抗原或半抗原；质控线红色且T区显红为阴性 分子或原子中的电子吸收能量跃迁后回到基态会发出光子，从而发光 常温下，伴随化学反应过程所产生的光的发射现象 直接参与发光反应的标记物 以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物 应的非酶标记物 标记物本身就是化学发光中的能量转移载体，发光底物；如鲁米诺类、吖啶酯类、苯酚类 即作催化剂，又参与化学发光反应 HRP对鲁米诺和H2O2起催化作用 ALP 以能量传递参与氧化反具体技术 化学发光免疫不直接参与化学发光反应；三联吡啶钌 以化学发光物质(如吖啶酯)直接标记Ag或Ab，发分析(CLIA) 化学发光酶免疫技术(CLEIA) 生物发光免疫分析(BLIA) 微粒子化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析 生免疫反应后，直接引发化学发光进行检测 采用催化某一发光反应的酶标记Ag或Ab，形成酶标记抗原-抗体化合物；加入了催化发光的酶，使发光速度加快 利用生物发光物质标记Ag或Ab 顺磁性微粒子为载体、用ALP标记；以AMPPD作为发光剂 三联吡啶钌是电化学发光免疫分析用的发光剂；检测广泛；持续时间长；信号强；灵敏度高等 第三部分：具体物质的检测 外周血WBC的分离 外周血单个核细胞分离 淋巴细胞分离 细胞分离法 淋巴细胞亚群的分离纯化 自然沉降法和高分子聚合物沉降法 密度梯度离心法； 玻璃器皿吸附；媳妇过滤；磁铁吸引 E玫瑰花结分离：T细胞能结合SRBC结合 尼龙分离：T细胞表面绒毛短少，B则多长、易吸附在在尼龙毛上 亲和板结合法：单抗与不同亚群的淋巴细胞结合在板上不易被洗掉 流式细胞仪分选法 磁性激活细胞分离器分离法：用于T细胞亚群分离 表面标志检测 免疫细胞的检测 T细胞受体检测 用间接免疫荧光、酶免疫技术等检测T细胞表面的表面标志，如CD分子和MHC等 E受体检测 人T细胞有SRBC抗体，可形成玫瑰花环 3H-TdRIL-2受体检测 双抗体夹心、ELISA等 T细胞增殖试掺入法 验 MTT比色法 形态学检查 51CrT细胞检测 T细胞功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验 抑制性T细胞功能检测 释放法 CTL介导的细胞凋亡检测法 利用ConA诱导Ts细胞，比较诱导与未经诱导的T对B抗体产生的抑制，评价T市功能 表面抗原检测 B细胞受体检B细胞检测 测 B细胞功能检测 检测CD19、CD20、CD22等 SmIg标志的检测 花环形成试验 检测B细胞表面的Fc受体 体内检测 体外检测 免疫球蛋白测定 血清中血型抗体的测定 反向溶血空斑形成实验等
免疫学检验总结表格
