蛋白质纯化
一.可溶性蛋白的纯化
方法 AC IEX GF 粗分离 + + - 中度纯化 + + - 精细纯化 - + + 1. 盐析
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白,可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到一定的浓度离心沉淀,上清继续加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化
Tag His GST MBP Strep(II) Flag
Size (aa) 6 218 396 8 8 Capacity (mg/ml) 40 10 10 6 0.6 MW (kDa) 1 26 42.5 1 1 Cleavage TEV/ Thrombin Thrombin/ PreScission TEV No need No need Elution Imidazole Glutathione reduced maltose desthiobiotin Flag peptide 2.1. Ni柱纯化
2.1.1.Ni柱纯化操作流程
1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥ 60 min);也可以让上清液缓慢流经Ni柱(≥6 sec/drop)。
2. 上清与填料混合后,低速离心(≤ 500 x g),吸去大部分上清,然后将填料悬起,加入柱子中。也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积(CV)的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白,然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱(如10,20,30,40,50 mM),然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后,用高浓度咪唑(如200 mM)洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外,透析除去咪唑,并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。当需要切除时:
1)TEV:咪唑对其没有影响,可以在洗脱后直接酶切。100 OD280的蛋白质最少可用1 OD280的TEV切过夜,温度20或4℃(20℃的效率是4℃的三倍)。 2) Thrombin:必须先除去咪唑才能进行酶切。在1 x PBS中,10 U/mg 蛋白质,4或20℃酶切过夜。可适当加大酶量或延长酶切时间。
2.1.2.Ni柱纯化注意事项
1.新的Ni柱填料存放于20%乙醇中(体积约为1:1)。在取用前,请先估算目的蛋白质的量,再决定取用的填料体积(Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads)。填料用量不要大大超过所需量,不然会结合较多的杂蛋白,难以清洗干净。
2.新填料使用前,要先进行处理和平衡。填料先用ddH2O冲洗,除去乙醇。再用至少5 CV的buffer进行平衡。
3. 在使用前后,要注意不能让填料放干,不然会影响纯化的效果。
3. 每次使用结束后,填料用高浓度咪唑(如500 mM)清洗,再用ddH2O清洗,最后保存在20%乙醇中。
4. 不推荐Ni柱在柱酶切,这样效率很低。
5. 多次使用后填料需再生。再生步骤为:5 CV H2O → 3 CV 2% SDS→ 1 CV 25% EtOH → 1CV 50% EtOH → 1 CV 75% EtOH → 5 CV 100% EtOH →1 CV 75% EtOH → 1CV 50% EtOH → 1 CV 25% EtOH → 1 CV H2O → 5 CV 100 mM EDTA, pH 8.0 → H2O → 2 CV 100 mM NiSO4 → 2 CV H2O→20% EtOH。
2.1.3. Q & A
1. 目的蛋白质挂柱能力差?
可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如?-ME等。Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。还可能是由于蛋白质折叠不正常,或折叠时将his tag包裹在内所致。可以采用的方法是:1)控制破菌条件,不可以过于剧烈;2)改变buffer条件,可能有利于蛋白质折叠稳定;3)将his tag构建到蛋白质另一端。
2. 杂蛋白很多,无法清洗干净?
解决方案有:采用更高浓度的咪唑进行清洗;在破菌或结合时加入少量咪唑(如10 mM);减少填料使用量。
3. 蛋白质洗脱不下来?
解决方案有:采用更高浓度的咪唑进行洗脱;更换buffer。
4. 蛋白质发生降解?
更换蛋白质抑制剂,或多种抑制剂混合使用;截取其它truncates。
2.2. GST柱纯化
2.2.1.GST柱纯化操作流程
1. 蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合,或可以让上清液缓慢流经GST柱(≥6 sec/drop);
2. 在充分混合后,将混有填料的上清load上柱子;
蛋白质纯化方法及问题解答
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