实时荧光定量PCR
组织RNA提取:
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng,100mg肺提取RNA 200ng,脑内的RNA丰度适中,100mg脑组织,提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。 反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。 反转录反应条件如下。 37°C 15 min(反转录反应) 85°C 5 sec(反转录酶的失活反应)
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子(BDNF)为目标基因,核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
基因 NR2B NR2B(+) 引物序列 CCGCAGCACTATTGAGAACA ATCCATGTGTAGCCGTAGCC TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA CGTTTATGGTCGGAACTACGA 扩增片段长度 213 bp NR2B(–) 18s rRNA 18s rRNA(+) 198 bp 18s rRNA(–)
1) 按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。 试剂 SYBRPremix Ex Taq(2×) PCR Forward Primer(10 μM) PCR Reverse Primer(10 μM) 模板(cDNA溶液) dH2O Total
? TM使用量 μl 1 μl 1 μl μl 10 μl 25 μl 终浓度 1× μM μM 全班40人,分为5组,每组做8管。4管做BDNF,4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA,采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板,一个模板采用原液浓度,一个模板采用稀释一倍浓度,体积均为 μl。
2)三步法PCR
首先95°C 作用3 min。 PCR进行35个循环。
步骤 温度
95°C 变性
时间
30 秒
退火 延伸 融解曲线
温度 95°C 55°C 95°C
58°C 72°C 30 秒 30 秒
时间 0秒 15秒 0秒 变温速度 20°C/秒 20°C/秒 0.1°C/秒
实时荧光定量PCR详细操作步骤
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