实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。 反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。 反转录反应条件如下。 37°C 15 min（反转录反应） 85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
基因 NR2B NR2B(+) 引物序列 CCGCAGCACTATTGAGAACA ATCCATGTGTAGCCGTAGCC TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA CGTTTATGGTCGGAACTACGA 扩增片段长度 213 bp NR2B(–) 18s rRNA 18s rRNA(+) 198 bp 18s rRNA(–)
1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 SYBRPremix Ex Taq（2×） PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） 模板（cDNA溶液） dH2O Total
? TM使用量 μl 1 μl 1 μl μl 10 μl 25 μl 终浓度 1× μM μM 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。 PCR进行35个循环。
步骤 温度
95°C 变性
时间
30 秒
退火 延伸 融解曲线
温度 95°C 55°C 95°C
58°C 72°C 30 秒 30 秒
时间 0秒 15秒 0秒 变温速度 20°C/秒 20°C/秒 0.1°C/秒
实时荧光定量PCR详细操作步骤
