主要培养基：
10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）： 溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。 500×B（0.02%生物素）：
溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。 100×AA（0.5%各种氨基酸）： 溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL
水中，过滤除菌，存于4℃。 10×D（20%葡萄糖）：
溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1
年。
500×生物素(0.02%)：
溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。 100×H（0.4%组氨酸）：
溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，
可放1年。 10×M（5%甲醇）：
混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。 10×GY（10%甘油）：
混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年
以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）： 溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL
水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。 1mol/L磷酸钾缓冲液 pH6.0：
32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如
果需调pH值，用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。 100mg/mL遗传霉素：
用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。 LB培养基：
5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。 LB平板培养基
在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。 LA平板培养基
待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。
YPD培养基：
1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖； RDB
转化固体培养基：(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine)
（ lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，1.34% Yeast Nitrogen Base with Ammonium
Sulfate with amino acids(YNB)，0.00004%Biotin，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂；） 100mL：超纯水 80ml，山梨醇 18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L）
121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml,
10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml 100*AA（含每种氨基酸0.5%）1ml.混匀，倒平板。 YPD-遗传霉素平板：
1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素4.0，250mL
（8-10个遗传霉素平板）。取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。
0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml五个梯度 MD：
选择培养基：(Minimal Dextrose Medium+ Histidine) （1.34%YNB，0.00004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂；）
100mL： 向80 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml，混匀，倒平板。 MM：
选择培养基：(Minimal Methanol+ Histidine )（1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.05%甲醇，1.5%琼脂；）
100mL：向90 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B（0.02%生物素）0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。 BMGY：
诱导表达培养基 (Buffer Glycerol-complex Medium) （ 1%酵母提取物，2%蛋白陈，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，0.00004% Biotin，l%甘油(V/V)；） 1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨 20g/L，K2HPO4 3g/L， KH2PO4 11.8G/L，超纯水 890Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B（0.02%生物素）1ml，甘油10mL。 BMMY：
诱导表达培养基 (Buffer Methanol-complex Medium) 除以0.5%甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。
1L：酵母提取物 10g/L， 蛋白胨 20g/L， K2HPO4 3g/L， KH2PO4 11.8G/L，超纯水 895Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml，500*B（0.02%生物素）1ml，5mL甲醇。
主要溶液
2*SDS样品缓冲液：
25mL 4*Tris?HCl，PH6.8(0.lmol/L) 20mL甘油[20%(w/v)] 4g SDS[4%(w/v)] 2mL2-巯基乙醇或3.1g DTT 1mg溴酚兰[0.001%(w/v)]
加蒸馏水至l00mL并混匀，等量分装成lmL于-70℃贮存。 5*SDS电泳缓冲液：
15.lgTris碱(0.125mol/L) 72.0g甘氨酸(0.96mol/L) 5.0g SDS[0.5%(w/v)] 使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液，贮存液不必调教pH值，稀释后溶液pH8.3，
使用前于0-4℃保存。
考马斯亮兰染色 固定液：
50%(v/v)甲醇 10%(v/v)乙酸 40%重蒸水 染色液：
50%(v/v)甲醇 0.05%(v/v)考马斯亮兰R-250 40%重蒸水 10%(v/v)乙酸
配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰，再加入乙酸和水。溶液可保存6个月，
若出现沉淀，滤除即可。 脱色液：
7%(v/v)乙酸 5%(v/v)甲醇 88%重蒸水
一、大肠制备感受态细胞 需灭菌的设备 大离心管：
小离心管：50ml 大枪头5ml LB培养基： 10%甘油
1 挑单个大肠接入LB液体培养基，培养过夜37℃摇床，并做抗性对照。 2以1：100比例接菌，进行大摇（2ml接入200ml 培养基中37℃摇床）
3OD达到0.5-0.7时，冰上放置20min。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余
4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余 5加入1/2体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余
6加入1/4体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余
7加入适量灭菌10%甘油，一般500ml菌液加入2ml甘油，重悬， 8分装，每管40ul，先冻与液氮，然后放入-80℃保存
二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备
1．在含5mLYPD的50mL 离心管中，培养P. pastoris，30℃过夜； 2．取0.1-0.5mL过夜培养物，接种含50mL新鲜培养基的摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5；
3．在4 ℃，1 500 r/min离心5min收集细胞，用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞； 4．如上离心，用5 mL预冷的灭菌水悬浮细胞；
5．如上离心，用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞；
6．如上离心，用1 mL 预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5mL（可冻存80μL等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多）。
三、毕赤酵母电转化
1．取80μL上述细胞与5-10μL经S线性化DNA（约5-20ug）混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中； 2．在冰上放置5min；
3．根据所使用装置推荐的S. cerivisiae参数进行电击(1 500V，5ms)； 4．立即加入1mL 预冷的1mol/L山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中； 5．分成200-600μL等份，涂于RDB平板上，进行His营养缺陷筛选； 6．在30℃孵育平板3-5d，至His+克隆产生。
四．G418筛选多拷贝基因
1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达；
2）第一块加入2ml 灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块； 3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块； 4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o；
5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50＝200ul每块G418板，G418浓度从0.25－4.0mg/ml各一块；
6）注意涂布均匀，可适量补充ddH2o，
7）300C烘箱培养，2－5day，其余菌液可40C保存 注：
a）手册推荐方法：第4）步将菌液转入EP管中，振荡5－10秒，用分光光度计
测菌体密度，1OD600＝5×107 cells/ml, 取一定体积稀释至200ul/每块G418板, 涂布～105 cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。
五．表达：
1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，颜色乳白； 2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管；
3）每隔24小时加千分之五甲醇；
4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析；
5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀；
6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，Western Blotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等
六．质粒提取（碱裂解） （1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。
取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。 （2）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，现用现配。
10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。 （3）溶液III：配制100 ml。
5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。 （4）5 mol/L 乙酸钾（200 ml）
乙酸钾98.14 g，溶解于160 ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200 ml。 （5）3 mol/L 乙酸钠（NaAc）（pH5.2)
取乙酸钠（CH3COONa.3H2O) 204.1g，溶解于200 ml双蒸去离子水中，用冰乙酸调pH5.2，双蒸去离子水定容至500 ml，高压灭菌后4℃保存。 （6）10 mol/L NaOH溶液（100 ml） NaOH晶体40 g，加水至100 ml。
（7）10%SDS
称取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68℃助溶，加数滴1 mol/L HCl调pH7.2,定容至100 ml。
（8）0.5 mol/L EDTA（pH8.0) （100 ml）。 Na2EDTA.2H2O 18.61 g, H2O 70 ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近pH8.0时才充分溶解，大约需NaOH 2g。最后加水至100 ml。 2、质粒的提取
（1）吸取1.5毫升菌液至1.5 ml Eppendorf离心管中，3 000 rpm离心3分钟，弃上清液。
（2）加上1.5毫升菌液，重复操作（１）。
（3）用移液器尽可能除去上清液，加入预冷150微升溶液Ｉ，震荡。
（4）加入200微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次，勿震，混合均匀。室温下放置５分钟。 （5）加入150微升溶液Ⅲ，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。４℃，12,000 rpm离心5分钟。
（6）用移液器将上清液转移到新的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入１倍体积（400微升）异丙醇抽提，12 000 rpm离心５分钟。
（7）弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀一次，离心5-10min （8）弃上清，烘干10min。 （9）加20微升TE缓冲液（含20ul/ml RNase）溶解DNA沉淀，37℃半小时，-20℃保存。
实验流程：
1. pPIC9K+pulluGene（histag）——GS115（His缺陷筛）——G418筛——
GS115-Pullu——酶活性鉴定
2. pulluGene分析——选择tRNA Genes——设计引物以GS115基因组为模板
PCR——tRNA Genes
3. pFLDa+ tRNA Genes——GS115-Pullu（zeocin筛）——GS115-Pullu-plus——酶
活鉴定——表达量比较
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
