第３５卷 第６期２０１６年 １２月北京生物医学工程
ＢｅｉｊｉｎｇＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ??３５ Ｎｏ??６Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１６
基于ＦＲＥＴ荧光蛋白探针的活体定量分子影像方法探究
王颖奇１ 唐吉１ 刘晴１ 白净１ 刘晓冬１，２
摘 要 目的荧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）探针由于自身仍存在诸多局限，其在活体成像领域尚未得到广泛应用。本文旨在解决ＦＲＥＴ探针在活体定量分子影像应用中所存在的瓶颈问题，即如何利用ＦＲＥＴ探针精准计算目标物浓度，以及如何基于ＦＲＥＴ探针实现三维成像。方法基于探针和目标物结合时的化学反应平衡关系，提出一种新型分析方法，以精确定量待测物［钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）］的浓度。同时对于ＦＲＥＴ探针的活体分子成像，结合荧光透射成像（３Ｄ－ＦＭＴ）方法，建立了可进行三维时空动态ＦＲＥＴ检测的平台系统，对ＦＲＥＴ探针的测量结果（即待测物浓度）进行实时定量的三维重建。结果准确地定量了待测物ＣａＭ浓度，并得到了高质量的３Ｄ－ＦＲＥＴ分布影像。结论提出ＦＲＥＴ探针在活体成像应用领域两个关键问题的解决方案，为基因编码ＦＲＥＴ探针向活体分子影像领域的推广奠定了重要的技术基础。
关键词 荧光共振能量转移；基因编码ＦＲＥＴ探针；荧光蛋白；荧光断层成像；钙调素ＤＯＩ：１０??３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－３２０８??２０１６．０６．０３．
中图分类号 Ｒ３１８；Ｑ６３１ 文献标志码 Ａ 文章编号 １００２－３２０８（２０１６）０６－０５６６－０５
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｎ?ｖｉｖｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｂａｓｅｄｏｎ
ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ?ｅｎｃｏｄｅｄＦＲＥＴｐｒｏｂｅｓ
１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４；【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｈｅｒｅ’ｒｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ
２ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４ＷＡＮＧＹｉｎｇｑｉ１，ＴＡＮＧＪｉ１，ＬＩＵＱｉｎｇ１，ＢＡＩＪｉｎｇ１，ＬＩＵＸｉａｏｄｏｎｇ１，２
（ＦＲＥＴ）ｓｅｎｓｏｒｉｎｉｎ?ｖｉｖｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇａｎｄｏｕｒｒｅｓｅａｒｃｈａｒｅｔｒｙｉｎｇｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｍ??Ｏｎｅｏｆｔｈｅｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ
ｐｒｏｂｌｅｍｓｉｓｈｏｗｔｏｑｕａｎｔｉｆｙｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｆｏｒｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｒｏｂｅｓａｎｄｔａｒｇｅｔｓ??Ｔｈｅｏｔｈｅｒ
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ｔｅｃｈｎｉｃａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ
ｔａｒｇｅｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｈｅｌｉｖｅｂｏｄｙ??ＭｅｔｈｏｄｓＷｅｔａｋｅａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＦＲＥＴｓｅｎｓｏｒｏｆｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣａＭ），ｂｅｔｗｅｅｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＣａＭａｎｄＢＳＣａＭＩＱ??ＷｅａｌｓｏｕｔｉｌｉｚｅＢＳＣａＭＩＱｉｎａ３－ＤＦＭＴｓｙｓｔｅｍ，ｂｙｗｈｉｃｈ３－ＤＦＲＥＴｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＦＲＥＴｐｒｏｂｅｓｔｏｑｕａｎｔｉｆｙｔａｒｇｅｔｅｄｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇｔｏｔｈｅ
基金项目：国家自然科学基金（３１３７０８２２，８１１７１３８２，８１３７１６０４）、北
京市自然科学基金（７１４２０８９）资助
作者单位：１清华大学医学院生物医学工程系（北京 １０００８４）
２清华大学生命科学学院（北京 １０００８４）
通信作者：刘晓冬，研究员。
Ｅ?ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏｄｏｎｇ＠ｍａｉｌ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｔｈｕｓｔｈｅＣａＭｄｙｎａｍｉｃｓｉｓａｔｔｅｍｐｔｅｄ??ＲｅｓｕｌｔｓｗｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣａＭｉｎｌｉｖｅ－ｃｅｌｌｓ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｗｉｔｈＦＲＥＴｐｒｏｂｅｓｉｎｖｉｖｏ??
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ；ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ?ｅｎｃｏｄｅｄＦＲＥＴｐｒｏｂｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ
第６期 王颖奇，等：基于ＦＲＥＴ荧光蛋白探针的活体定量分子影像方法探究
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０ 引言
ｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）探针是一种基于荧光共振能
荧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅ
一种全新的计算拟合方法，在活细胞内对ＢＳＣａＭＩＱ［５］与ａｐｏ－ＣａＭ的结合反应过程进行了多点拟合计算，定量出了不同状态下活细胞内ａｐｏ－ＣａＭ的准确浓度。
量转移的生物传感器［１］，一般的ＦＲＥＴ探针由荧光子发生相互作用时，会引发与其相连的荧光供体和荧光受体耦合角度及相对距离的变化，进而使荧光供体和受体之间的ＦＲＥＴ效率发生变化［２］。
ＢＳＣａＭＩＱ由Ｎ端的黄色荧光蛋白ＹＦＰ、Ｃ端的
供体、荧光受体以及传感器构成，当传感器与特定分
１ 定量算法与实验设计
１??１ 针对ＦＲＥＴ探针的新型定量算法
在计算ＦＲＥＴ比率时参考３３－ＦＲＥＴ算法［６］，其
核心是通过对照实验，采用逼近的方式计算出供体发射串扰与受体激发串扰。该算法可以得到精确的ＦＲＥＴ比率ＦＲ的值。在此基础上，提出了一种新的拟合计算方法，可以根据ＦＲ来准确定量活细胞内钙调素浓度。
有如下线性关系：
ＦＲ＝ＦＲｍａｘ－（ＦＲｍａｘ－ＦＲｍｉｎ）Ｓｂ
Ｓｂ＝
［Ｓｂ］
首先，ＦＲ与ＢＳＣａＭＩＱ结合ａｐｏ－ＣａＭ的比例Ｓｂ
（１）
青色荧光蛋白ＣＦＰ和连接它们的短肽组成［图１（ａ）］［３］。该短肽由２７个氨基酸组成：ＡＡＡＴＫ－ＫＧＥＫＫ。ＢＳＣａＭＩＱ可以与自由状态下的钙调素ａｐｏ－ＣａＭ相结合。在发生结合之前，ＢＳＣａＭＩＱ上的ＣＦＰ
ＩＱＡＡＦＲＧＨＩＴＲＫＫＬＫＧＥＫＫＧＡＡ。该短肽基于神经调制蛋白的ＩＱ域：ＡＡＡＴＫＩＱＡＳＦＲＧＨＩＴＲＫＫＬ－
（作为荧光供体）与ＹＦＰ（作为荧光受体）之间存在较强的ＦＲＥＴ，但在结合钙调素之后由于构象改变导致其ＦＲＥＴ效率降低，因而成为一种良好的钙调素指示剂。
钙离子（Ｃａ２＋）可以与ａｐｏ－ＣａＭ相结合，使其构
（２）
［Ｓｂ］＋［Ｓｆｒｅｅ］
式中：Ｓｂ是结合了ａｐｏ－ＣａＭ的ＢＳＣａＭＩＱ的比例；［Ｓｂ］是结合了ａｐｏ－ＣａＭ的ＢＳＣａＭＩＱ的浓度；［Ｓｆｒｅｅ］是自由的ＢＳＣａＭＩＱ的浓度。［Ｓｆｒｅｅ］的关系为：
验流程与实验材料）的平均荧光强度ＳＣＦＰ与［Ｓｂ］、 式中：ａ为成像设备参数，对于在同一设备上进行比对的不同实验结果而言，可以省略这一常数。
解离常数Ｋｄ为：
Ｋｄ＝
［Ｓｆｒｅｅ］［ａｐｏＣａＭ］
［Ｓｂ］
ＳＣＦＰ＝ａ（［Ｓｂ］＋［Ｓｆｒｅｅ］）
（３）
在成像过程中，单个细胞在ＣＦＰ通道（详见实
象发生变化，进而无法与ＢＳＣａＭＩＱ进行结合。因此，ＢＳＣａＭＩＱ是特异性的ａｐｏＣａＭ探针。ＢＳＣａＭＩＱ与ａｐｏ－ＣａＭ相互作用的过程可认为是一种化学结合过程，想要定量ａｐｏ－ＣａＭ的浓度，不仅需要计算出ＦＲＥＴ的测量比率（ａｐｐａｒｅｎｔＦＲＥＴｒａｔｉｏ或ＦＲ），还需要计算出参与反应的ＢＳＣａＭＩＱ的量，以准确算出ａｐｏ－
ＣａＭ的浓度。钙调素ＣａＭ与多种重要的生物学过程密切相关［４］。因此，精确定量活细胞内ａｐｏ－ＣａＭ浓度具有非常重要的意义。
真实的生理环境复杂多变，为在生理情况下使用ＢＳＣａＭＩＱ探针实现对ａｐｏ－ＣａＭ浓度的精确测量，使用已报道的定量效果最好的３３－ＦＲＥＴ算法来计算ＦＲＥＴ测量比率（等价于ＦＲＥＴ效率），并提出了
［Ｓｂ］＝
１
＋Ｋｄ＋Ｃ－ＳａＣＦＰ
假定属于同一细胞系的细胞在相同培养条件下细胞内的ａｐｏ－ＣａＭ总量是一定的，则： 结合式（３）～式（５），可以解出［Ｓｂ］，如下：
［ａｐｏＣａＭ］＋［Ｓｂ］＝Ｃ
（５）
（４）
由此，式（１）中所有参量则都可以通过测量和计算获得。在实际的实验过程中，对处于同一状态的细胞系，采集多个细胞的数据。在得到多组数据的情况下，通过式（１）对ＦＲＥＴ比率ＦＲ和供体荧光
?１?４Ｃ?ＳＣＦＰ＋Ｋｄ＋Ｃ÷－Ｓ
ａＣＦＰèａ?
２
（６）
强度ＳＣＦＰ进行最小二乘拟合，从而精确地还原出结以表征ＢＳＣａＭＩＱ浓度ＳＣＦＰ为横坐标。通过该结合曲线，可以准确计算出ａｐｏ－ＣａＭ的浓度。
合曲线。结合曲线以表征ＦＲＥＴ比率ＦＲ为纵坐标，
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１??２ ３Ｄ－ＦＭＴ成像平台上的实验设计
北京生物医学工程 第３５卷
活体ＦＲＥＴ检测领域的一大难点，主要原因有以下两点。
多数使用的是非定量ＦＲＥＴ方法［７］（如ｐｂ?ＦＲＥＴ、比例ＦＲＥＴ等），这些方法无法准确计算出ＦＲＥＴ，无法对待测分子进行准确定量，因而不具备向活体检测一是在已报道的活体ＦＲＥＴ检测方法中，绝大
ＦＲＥＴ探针如何与三维荧光重建相结合一直是
２ 实验结果与分析
２??１ 活细胞内ａｐｏＣａＭ的定量分析
在实验中，使一组细胞单独表达ＢＳＣａＭＩＱ，另一
组细胞则共表达ＣａＭ和ＢＳＣａＭＩＱ。实验结果如图１
（ｂ）所示：红色的点和线表征了ＢＳＣａＭＩＱ仅与细胞内源性的钙调素结合的情况，而黑色的点和线表征了在过表达钙调素情况下ＢＳＣａＭ与钙调素的结合情领域推广的可能性。
二是ＦＲＥＴ比率的三维重建是一项具有挑战性的工作［８］ＦＲＥＴ，由于所获得的荧光强度信息直接用于性要求非常高比率等重要参数的计算。
，所以对成像的精确－首次在ＦＲＥＴ结合ＦＲＥＴ，实现了算法与三维荧光透射成像探针实验中将定量效果最好的ＦＲＥＴ探针ＢＳＣａＭ（３Ｄ－ＦＭＴ）平台相
３３
比率的时空动态三维重建ＩＱ在仿体（准活体）上ＦＲＥＴ。
１??３ 实验流程与实验材料宽场荧光显微镜下的ＦＲＥＴ检测采用３３方法中标准的３通道３样品的方式进行。３通道分－ＦＲＥＴ
别为：ＣＦＰ通道，采用ＣＦＰ激发波长，接收ＣＦＰ发射波长ＦＲＥＴ，使用长，使用通道４４０，４４０采用ｎｍｎｍ激发滤光片ＣＦＰ激发滤光片激发波长，４８０，５３０，接收ｎｍ发射滤光片ｎｍ发射滤光片ＹＦＰ发射波；ＹＦＰ通道，；
长，使用４８８采用ｎｍ激发滤光片ＹＦＰ激发波长，５３０，ｎｍ接收发射滤光片ＹＦＰ发射波。３样品分别为：实验组（表达蛋白依据实验目的而定）；ＣＦＰ单独对照组（单独表达ＣＦＰ）；ＹＦＰ单独对照组（单独表达ＹＦＰ）。ＦＲ的具体计算过程请参考文献［６］，本篇不再赘述。
在３Ｄ－ＦＭＴ平台上，采用相同参数的滤光片构建同样的三通道。为了实现三维重建，得到更多的空间分布信息，每次成像时，对样品进行了１２个角度的３６０°旋转成像，将１２个角度下的３３算结果进行重建，并最终得到三维水平的－ＦＲＥＴＦＲＥＴ计分布（图２）。
ＢＳＣａＭ在活细胞实验中，以ｐｃＤＮＡ３??１为载体，构建了
ＩＱ质粒和ＣａＭ质粒。以ＨＥＫ２９３Ｔ细胞系作为表达体系，将质粒通过ｌｉｐｏ２０００试剂进行转染。
在３Ｄ－ＦＭＴ成像中，以从细胞表达体系中纯化出来的蛋白质为样本，表达方式与在活细胞中相同。
况。通过新型计算拟合方法和拟合函数得到了两个ＩＱ重要的参数———完全无外源性ａｐｏ－ＣａＭ时ＢＳＣａＭ的ＦＲＥＴ比率指数ＦＲ－ＣａＭＩＱ的总浓度，分别为４??７８ｍａｘ和过表达时胞内ａｐｏμｍｏｌ／Ｌ和１１??４５μｍｏｌ／Ｌ，从而实现了对ａｐｏ－ＣａＭ浓度的精确定量。
图１ ＢＳＣａＭＩＱ在有或无外源性钙调素情况下
与ＣａＭ的结合曲线
Ｆｉｇｕｒｅ１ ＢｉｎｄｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆＢＳＣａＭＩＱａｎｄＣａＭｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｅｘｏｇｅｎｏｕｓＣａＭｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
２??２ ３Ｄ载体成像实验结果
如图２（ａ）所示，ＦＭＴ成像平台由多部分构成，核心部分为一个可旋转的成像平台，其中放置一个装满脂肪乳的容器，样品装入内径为４ｍｍ的细管，插入到脂肪乳中，以模拟真实生物体中组织的光学
基于FRET荧光蛋白探针的活体定量分子影像方法探究
