离。W=4σ
半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)—峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355σ 标准偏差(standard deviation,σ)—正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。
峰面积(peak area,A)—峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064 Wh/2h
2.定性参数(保留值)
死时间(dead time,t0)——不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume,V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速)
保留时间(retention time,tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积(retention volume,VR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F×tR
调整保留时间(adjusted retention结构time,t'R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时,t'R只决定于组分的性质,因此,t'R(或tR)可用于定性。t'R=tR-t0
调整保留体积(adjusted retention volume,V'R)——扣除死体积后的保留体积。V'R=VR-V0或V'R=F×t'R
3.柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number,N)——用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,
N可近似表示为:N=()2=16()2=5.54()2
N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)
若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N或Neff)。
理论塔板高度(theoretical plate height,H)——每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算:H=,H
4.相平衡参数
分配系数(distribution coefficient,K)——在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。K=。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件,在这种条件下,得到的色谱峰为正常峰;在许多情况下,随着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。
在同一色谱条件下,样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长,后流出色谱柱;K值小的组分则滞留时间短,先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大,越容易分离,因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的
有效
有效
=。
前提。
在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值,以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间,达到分离的目的。
容量因子(capacity factor,k)——化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的量之比。k=。因此容量因子也称质量分配系数。
分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系:k===K=,t'R=k t0。上式说明容量因子的物理意义:表示一个组分在固定相中停留的时间(t'R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时,化合物全部存在于流动相中,在固定相中不保留,t'R=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是:K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外,还与Vs、Vm有关。由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定,所以容量因子比分配系数应用更广泛。 选择性因子(selectivity factor,α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α==(设k2>k1)。因k=t'R/t0,则α=,所以α又称为相对保留时间(《美国药典》)。
要使两组分得到分离,必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说,α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间相互作用力的差异。
5.分离参数
分离度(resolution,R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率,表示相邻两峰的分离程度。R=。当W1=W2时,R=。当R=1时,称为4σ分离,两峰基本分离,裸露峰面积为95.4%,内侧峰基重叠约2%。R=1.5时,称为6σ分离,裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。
《中国药典》规定R应大于1.5。
基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系:
R=××
其中称为柱效项,为柱选择性项,为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关,后两项与色谱过程热力学因素有关。
从基本分离方程可看出,提高分离度有三种途径:①增加塔板数。方法之一是增加柱长,但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度,提高柱效。②增加选择性。当α=1时,R=0,无论柱效有多高,组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性:a. 改变流动相的组成及pH值;b. 改变柱温;c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法,可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时,R也趋于0;k2增大,R也增大。但k2不能太大,否则不但分离时间延长,而且峰形变宽,会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内,最好为2~5,窄径柱可更小些。
二、塔板理论
1.塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔,把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程,即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为:
1) 色谱柱内存在许多塔板,组分在塔板间隔(即塔板高度)内完全服从分配定律,并很快达到分配平衡。
2) 样品加在第0号塔板上,样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3) 流动相在色谱柱内间歇式流动,每次进入一个塔板体积。 4) 在所有塔板上分配系数相等,与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符,如色谱过程是一个动态过程,很难达到分配平衡;组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程,成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置,能够评价色谱柱柱效。
2.色谱流出曲线方程及定量参数(峰高h和峰面积A)
根据塔板理论,流出曲线可用下述正态分布方程来描述:C=e或C=e 由色谱流出曲线方程可知:当t=tR时,浓度C有极大值,Cmax=。Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明:①当实验条件一定时(即σ一定),峰高h
与组分的量C0(进样量)成正比,所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时,σ越小(柱效越高),峰高越高,因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由流出曲线方程对V(0~∞)求积分,即得出色谱峰面积A=×σ×Cmax=C0。可见A相当于组分进样量C0,因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入上式,即得A=1.064×Wh/2×h,此为正常峰的峰面积计算公式。 三、速率理论(又称随机模型理论) 1.液相色谱速率方程
1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念,并把影响塔板高度的动力学因素结合起来,提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程,研究过程中的动力学因素对峰展宽(即柱效)的影响。
后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程(H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程)的基础上,根据液体与气体的性质差异,提出了液相色谱速率方程(即Giddings方程):H=2λdp++\\s\%up5(2p+\\s\%up5(2p+\\s\%up5(2f 2.影响柱效的因素
1)涡流扩散(eddy diffusion)。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同,分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径,λ为填充不规则因子,填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3~10μm,最好3~5μm,粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀(λ大),且会使柱压过高。大而均匀(球形或近球形)的颗粒容易填充规则均匀,λ越小。总的说来,应采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效。毛细管无填料,A=0。
2)分子扩散(molecular diffusion)。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2γDm/u。u为流动相线速度,分子在柱内的滞留时间越长(u小),展宽越严重。在低流速时,它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数,由于液相的Dm很小,通常仅为气相的10-4~10-5,因此在HPLC中,只要流速不太低的话,这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向
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