南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（4）：914-921·914·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com51卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.04.023响应面法优化番木瓜叶总黄酮提取工艺
吕金慧，马
洁，王府润，于
靖，陈
萍*
（海南大学园艺学院，海口
570228）
摘要：【目的】利用响应面法优化番木瓜叶总黄酮的超声波辅助提取工艺，为番木瓜叶中黄酮类成分提取及番木瓜叶综合开发利用提供技术支持。【方法】利用超声波提取番木瓜叶片总黄酮，采用氯化铝显色法测定总黄酮含量，选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声波时间（C）和超声波温度（D）为试验因素，总黄酮提取率（Y）为响应值，在单因素试验的基础上进行Box-Behnken中心组合试验设计，建立回归方程，优化总黄酮提取工艺。【结果】建立的回归方程：Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2。4个因素对番木瓜叶总黄酮提取率的影响排序为料液比>乙醇体积分数>超声波时间>超声波温度，两因素间的交互作用以料液比与超声波时间的交互作用对总黄酮提取率影响最大，而料液比与超声波温度的交互作用影响最小。最佳提取工艺条件：乙醇体积分数79%、料液比1∶72（g/mL）、超声波时间42min、超声波温度50℃，实际总黄酮提取率为4.15%，与理论预测值（4.18%）接近。【结论】采用响应面法优化超声波辅助提取番木瓜叶总黄酮的工艺条件稳定可行，可在生产实际中推广。
关键词：番木瓜；叶片；总黄酮；超声波提取；响应面法中图分类号：S667.9；TS255.36
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2020）04-0914-08
Optimizationofextractionprocessoftotalflavonoidsfrom
papayaleavesbyresponsesurfacemethodology
LYUJin-hui，MAJie，WANGFu-run，YUJing，CHENPing*
（CollegeofHorticulture，HainanUniversity，Haikou570228，China）
Abstract：【Objective】Theresponsesurfacemethodology（RSM）wasusedtooptimizetheultrasonic-assistedextrac-tionprocessoftotalflavonoidsinpapayaleaves，providingtechnicalsupportfortheextractionandseparationofflavo-noidsinpapayaleavesandthecomprehensivedevelopmentandutilizationofpapayaleaves.【Method】Ultrasound-assisted
extractionoftotalflavonoidsfrompapayaleaveswascarriedout.ThetotalflavonoidscontentwasdeterminedbyAlCl3chromogenicmethod.Thevolumefractionofethanol（A），thematerial-liquidratio（B），ultrasonictime（C），andultra-sonictemperature（D）wereselectedasdifferentexperimentalfactors.Basedontheexperimentofsinglefactor，thecom-binedexperimentaldesignofBox-Behnkencenterwascarriedout.Establishingregressionequationtooptimizetheextrac-tionprocessoftotalflavonoids.【Result】Establishedregressionequation：Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2.Theinfluenceorderofthefourfactorsonyieldoftotalflavonoidsinpapayaleaveswasmaterial-liquidratio>ethanolvolumefraction>ultrasonictime>ultrasonictemperature.Theinteractionbetweenthematerial-liquidratioandtheultrasonictimehadthegreatesteffectontheextractionrateoftotalflavonoids，andtheinteractionbetweenthematerial-liquidratioandtheultrasonictemperaturehadtheleasteffect.Theoptimalprocessconditionswere：ethanolvolumefraction79%，solid-liquidratio1∶72（g/mL），ultrasonictime42min，andultrasonictemperature50℃.Theactualverificationvalueofthetotalflavonoidextractionratewas4.15%，whichwasclosetothetheoreticalprediction（4.18%）.【Conclusion】Theresponsesurfacemethodisusedtooptimizetheultrasonic-assistedextractionofthetotalflavonoidsinpapayaleaves，whichisstableandfeasible，andcanbepopularizedinproduction.
Keywords：papaya；leaves；total?avonoids；ultrasonicextraction；responsesurfacemethodologyFoundationitem：NationalNaturalScienceFoundationofChina（31560544）收稿日期：2019-08-29
基金项目：国家自然科学基金项目（31560544）作者简介：*为通讯作者，陈萍（1977-），博士，教授，主要从事热带果树与农业生物技术教学及研究工作，E-mail：chenping199607@
163.com。吕金慧（1994-），研究方向为热带果树与农业生物技术，E-mail：lvjinhuixue@163.com
4期吕金慧等：响应面法优化番木瓜叶总黄酮提取工艺
·915·0引言
【研究意义】番木瓜（CaricapapayaL.）为番木瓜科番木瓜属植物，原产于中美洲地区（Liuetal.，2018），被称为“岭南果王”（周常清等，2014）。番木瓜含有丰富的营养成分，具有一定的药用和食用价值（Ikrametal.，2015），其乳液可治疗烫伤、溃疡等病症，提高人体免疫力和抗病原体（Saeedetal.，2014），其果实可制作泻药（deOliveiraandVitória，2011）。番木瓜中富含的总黄酮具有很强的抗氧化、消炎和抑菌能力（肖健和谭恩灵，2012）。黄酮类物质是一种天然植物产生的次生代谢产物（RoutrayandOr-sat，2012），有降低胆固醇、预防老年人高血压和脑出血等功效（侯学敏等，2013）。番木瓜中的黄酮类化合物还具有抗肿瘤作用（Otsukietal.，2010）。番木瓜叶片中富含黄酮类物质，因此，优化番木瓜叶中总黄酮的提取工艺，不仅能有效提取总黄酮成分，节约成本，还可更好地利用番木瓜植株叶片，减少环境污染。【前人研究进展】近年来，许多学者开始研究番木瓜中生物活性成分。李泽友等（2011）利用气相色谱法检测到番木瓜种子中的异硫氰酸苄酯含量最高；汪修意等（2013）综述了近几年来关于番木瓜中黄酮类物质的研究进展；汪修意（2014）研究发现番木瓜叶和果中均含有番木瓜碱，番木瓜叶中还含有去氢番木瓜碱Ⅰ、去氢番木瓜碱Ⅱ和伪番木瓜碱。对于番木瓜叶有效成分的提取和测定，Owoyele等（2008）研
究发现番木瓜叶片的乙醇提取物具有抗炎作用；袁竹连（2013）以丙醇和乙醇为提取剂，提取并测定了番木瓜叶片的叶绿素含量；杜丽清等（2016）利用甲醇作提取剂，研究了番木瓜叶片中总酚的抗氧化活性；但鲜见提取番木瓜叶中总黄酮的研究报道。近年来，响应面法优化超声波辅助提取工艺被广泛应用于提取植物叶片总黄酮，如提取枸杞叶（韩爱芝等，2013）、蜡梅叶（徐萌等，2016）、华中枸骨叶（杜银香等，2019）、柿叶（袁秀平等，2019）的总黄酮。通过超声波破坏植物细胞壁，让溶剂进入细胞，酮类物质能充分扩散，从而提高提取效率（PatistandBates，2008）。【本研究切入点】目前关于番木瓜总黄酮提取工艺的研究较少，利用响应面法（KhuriandMukho-padhyay，2010）优化超声波辅助提取番木瓜叶总黄酮工艺的研究更是鲜见报道。【拟解决的关键问题】在单因素试验基础上，利用响应面法优化超声波辅助提取番木瓜叶总黄酮工艺，以期有效提取其总黄酮，为番木瓜叶片综合开发利用提供技术支持。
1材料与方法
1.1
试验材料
番木瓜叶片采自海南大学热带农林学院实践基地，干燥、粉碎后密封备用。氢氧化钠、氯化铝、芦丁、乙醇和亚硝酸钠均为分析纯，购自广州化学试剂厂。主要仪器设备：新世纪紫外可见分光光度计（T6，北京普析通用仪器有限公司）、台式高速冷冻离心机（TGL-16S，四川蜀科仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-4A，金坛市精达仪器制造有限公司）、超声波清洗机（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司）。1.2试验方法
1.2.1标准曲线绘制参考赵熙等（2010）的方法，并进行一定优化。称取5mg芦丁，用无水乙醇定容至50mL，得到质量浓度为0.10g/L的芦丁溶液，稀释成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10g/L。稀释后的不同质量浓度芦丁溶液均按顺序依次加入5%亚硝酸钠0.15mL，放置6min；10%氯化铝0.15mL，放置6min；4%氢氧化钠2mL和蒸馏水5mL，静置15min；最后在510nm波长处测吸光值。以标准芦丁溶液质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程：y=1.6867x+0.0058（R2=0.9973），线性关系良好（图1）。
００．２０ec０．１８y=1.6867x+0.0058nab０．ros０．１R2１６４=0.9973bA０．１２值光０．１０吸０．０．０８０．００６０．．０４０２００．０００．０５０．１００．１５芦丁质量浓度（g/L）Rutinmassconcentration图1芦丁标准曲线
Fig.1Standardcurveofrutin
1.2.2番木瓜叶总黄酮提取称取一定质量的番木瓜叶粉末，变换不同的反应条件进行提取。1.2.3番木瓜叶总黄酮测定参考于靖（2015）的方法，稍作修改。使用1.2.2中提取的样品，吸取上清液1mL，根据1.2.1的方法测定样品吸光值，计算总黄酮提取率。
总黄酮提取率（%）=YV（/m×1000）×100式中，Y为总黄酮质量浓度（g/L），V为乙醇体积（mL），m为叶片粉末质量（g）。
·916·南方农业学报51卷1.2.4单因素试验
1.2.4.1料液比对番木瓜叶总黄酮提取率的影响称取0.1g叶片粉末，超声波功率200W，超声波处理1h，离心20min，吸取上清液，比较不同料液比［1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶100、1∶120和1∶140（g/mL，下同）］对番木瓜叶中总黄酮提取率的影响。
1.2.4.2乙醇体积分数对番木瓜叶总黄酮提取率的影响根据1.2.4.1优化的结果，超声波处理1h，离心20min，设乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%和90%。
1.2.4.3超声波温度对番木瓜叶总黄酮提取率的
表1响应面试验因素与水平
Table1Factorsandlevelsusedforresponsesurfaceanalysis
水平Level-101
A：乙醇体积分数（%）Ethanolvolumefraction
708090
影响使用优化的料液比和乙醇体积分数，超声波处理1h，设超声波温度分别为30、40、50、60和70℃。
1.2.4.4超声波时间对番木瓜叶总黄酮提取率的影响使用优化后的料液比、乙醇体积分数和超声波温度，设超声波时间分别为20、40、60、80、100和120min。
1.2.5响应面试验设计根据单因素试验结果确定各因素的水平范围，以番木瓜叶总黄酮提取率（Y）为响应值，利用Design-Expert8.0.6进行Box-Behnken试验设计（傅予等，2017）。Box-Behnken相应试验的设计因子和编码值见表1。
因素Factor
B：料液比C：超声波时间（min）Material-liquidratioUltrasonictime
1∶80201∶70401∶6060
D：超声波温度（℃）
Ultrasonictemperature
405060
1.3
统计分析
利用Design-Expert8.0.6进行Box-Behnken试验设计及数据分析，同时利用Excel2017进行数据整理和绘制图表。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1料液比对番木瓜叶总黄酮提取率的影响由图2可知，料液比在1∶20~1∶70范围内，提取溶剂体积不断增大，番木瓜叶总黄酮提取率逐渐升高，当料液比为1∶70时，总黄酮提取率达最大值（1.23%）；之后提取溶剂体积继续增大，料液比继续减小，总黄酮提取率反而降低。综合节约原料成本和总黄酮物质提取效率两方面考虑，选择料液比1∶70为宜。
总黄酮提取率（%）Totalflavonoidextractionrate2.1.2乙醇体积分数对番木瓜叶总黄酮提取率的影响从图3可看出，在一定范围内，番木瓜叶总黄酮提取率随乙醇体积分数的增加而逐渐升高，乙醇体积分数为80%时总黄酮提取率达最大值（3.09%）。这可能是因为相似相溶，即溶出度最大出现在极性相似时，乙醇体积分数为80%时乙醇和番木瓜叶片有相似的极性；随着乙醇体积分数的继续增大，总黄酮提取率有所降低。
总黄酮提取率（%）Totalflavonoidextractionrate３．５０３．００２．５０２．００１．５０１．００３０５０７０９０１１０１．４０１．２０１．０００．８００．６０乙醇体积分数（%）Ethanolvolumefraction０．４００．２０１：２1∶2０0１：３1∶3０0１：４1∶4０0１：５1∶5０0１：６1∶6０0１：７1∶7０0１：１1∶1０0０0１：８1∶8０0１：１1∶1２2０0１：１1∶1４4０0０．００图3乙醇体积分数对番木瓜叶总黄酮提取率的影响
Fig.3Effectsofethanolconcentrationontheextractionrate
oftotalflavonoidsfrompapayaleaves
料液比Material-liquidratio图2料液比对番木瓜叶总黄酮提取率的影响
Fig.2Effectsofmaterial-liquidratioontheextractionrateof
totalflavonoidsfrompapayaleaves
2.1.3超声波温度对番木瓜叶总黄酮提取率的影响从图4可看出，提取开始阶段番木瓜叶总黄酮提取率随着超声波温度的升高而增大，温度为50℃时，总黄酮提取率最高（2.98%）；温度继续升高，提取率反而降低，可能是温度过高会造成黄酮类物质部
响应面法优化番木瓜叶总黄酮提取工艺
