Botanical Research 植物学研究, 2020, 9(4), 320-327
Published Online July 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/br https://doi.org/10.12677/br.2020.94039
ITS, rps16 and trnL-F Sequence Analysis and Genetic Relationships of Allium macrostemon from Different Regions in China
Tian Shi, Zhongmei Mo, Min Wu, Cai Zhao*
College of Life Sciences, Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Guizhou University, Guiyang Guizhou
Received: Jun. 5, 2020; accepted: Jun. 26, 2020; published: Jul. 3, 2020
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Abstract
40 Allium macrostemon Bunge individuals from different regions in China were used as materials to explore the genetic relationship. Their sequences of ITS, rps16 and trnL-F were amplified and sequenced respectively, and their sequence characteristics and genetic relationship were ana-lyzed. Results showed that the average length of ITS, rps16 and trnL-F sequences was 590 bp, 587 bp and 622 bp respectively; the average content of G + C was 50.64%, 29.66% and 38.16% respec-tively. Based on ITS + rps16 + trnL-F sequence structure, the maximum parsimony (MP) and Baye-sian inference (BI) phylogenetic trees show that A. macrostemon is a monophyletic species, which can be generally divided into A group in Southwest China, B group in coastal area and C group in North and Northeast China. Research suggested that the populations with close genetic relation-ships and geographical location were also close, which indicated that ITS + rps16 + trnL-F se-quence could be used in the study of genetic relationship of A. macrostemon from different habi-tats. Based on ITS + rps16 + trnL-F sequence of A. macrostemon, resources from different habitats to construct phylogenetic tree could provide the genetic map and some scientific data for the de-velopment, protection, utilization and breeding of A. macrostemon resources.
Keywords
Allium macrostemon Bunge, ITS, rps16, trnL-F, Relationship
中国不同产地薤白ITS、rps16和trnL-F序列分析及亲缘关系分析
石 甜，莫忠妹，吴 敏，赵 财*
*通讯作者。
文章引用: 石甜, 莫忠妹, 吴敏, 赵财. 中国不同产地薤白ITS、rps16和trnL-F序列分析及亲缘关系分析[J]. 植物学研究, 2020, 9(4): 320-327. DOI: 10.12677/br.2020.94039
石甜 等
贵州大学生命科学学院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳
收稿日期：2020年6月5日；录用日期：2020年6月26日；发布日期：2020年7月3日
摘 要
本文为探讨不同产地薤白(Allium macrostemon Bunge)的亲缘关系，以40个来自我国不同产地的薤白为材料，分别以ITS、rps16及trnL-F序列进行扩增并测序，分析其序列特征及亲缘关系。结果显示：我国不同产地薤白ITS序列平均长度为590 bp，G + C平均含量为50.64%；rps16序列平均长度为587 bp，G + C平均含量为29.66%；trnL-F序列平均长度为622 bp，G + C平均含量为38.16%。基于ITS + rps16 + trnL-F联合序列构的最大简约法(maximum parsimony, MP)和贝叶斯(Bayesian inference, BI)系统发育树均表明，薤白为一单系种，总体可划分为位于西南地区的A组、沿海地区的B组和北方及东北的C组。研究表明，亲缘关系较近的居群，地理位置也较近，说明ITS + rps16 + trnL-F联合序列可用于不同产地薤白的亲缘关系研究中，可以提供亲缘关系图谱，为薤白资源的开发、保护、利用及育种提供一定的科学资料。
关键词
薤白，ITS，rps16，trnL-F，亲缘关系
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
1. 引言
Open Access 薤白(Allium macrostemon Bunge)为多年生草本植物，隶属石蒜科(Amaryllidaceae)葱属(Allium)，又称为小根蒜，其鳞茎可作蔬菜食用，也可作药用。广泛分布于东亚地区，在我国除新疆青海外，各省均有分布。薤白具有降脂、抗氧化及抗癌等功能，是一种非常具有开发价值的药物[1]。
随着分子生物学技术的飞速发展，对特定的DNA序列进行PCR扩增并进行测序成为分析植物亲缘关系的一种技术。核糖体DNA (nrDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)一般以高度串联重复的方式分布于高等植物的基因组中，具有变异速率高、序列长度保守、片段较小、易扩增及易分析等特点[2] [3]。叶绿体DNA (cpDNA)为单亲遗传，序列保守性较高，进化速率恒定[4]。ITS、rps16和trnL-F序列进化速率较快，遗传变异相对较高，适用于亲缘关系分析中[5] [6]。黄德青等[7]利用ITS和trnL-F序列对薤白的系统地位和分类等级进行了探讨，认为薤白为一单系种；莫忠妹等[8]采用ITS序列进行西南地区薤白的亲缘关系及地理分布格局研究，结果表明ITS序列可以鉴定不同地区薤白的亲缘关系。但中国中国地势西高东低，大致呈阶梯状分布，自然环境存在较大差异，因此在扩大研究居群的基础上来探讨全国不同地区薤白的亲缘关系的研究值得开展。本研究首次采集中国整个分布区域的40个不同薤白居群，利用ITS、rps16和trnL-F序列进行测序，分析其序列特征及全国不同产地薤白的亲缘关系，为薤白植物资源的开发、保护、利用及育种提供一定理论基础。
DOI: 10.12677/br.2020.94039
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2. 材料与方法
2.1. 试验材料
供试薤白共包含40个不同产地的自然居群，各居群均采集10~15个个体(表1)。野外采集薤白的新鲜叶片后立即用变色硅胶干燥，保存用于总DNA提取。参考黄德青等[7]研究选取用于本研究的葱属植物，其序列来自GenBank (表2)。
2.2. DNA提取、扩增及测序
采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取薤白总DNA。ITS、rps16、trnL-F序列扩增引物及扩增程序分别参照Wendel等[9]、Oxelman等[10]和Taberlet等[11]设计的引物及扩增程序(表3)，引物均由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。将琼脂糖凝胶电泳检测结果符合标准的产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化及单向测序。
Table 1. Information table of A. macrostemon from different producing areas 表1. 不同产地薤白信息表
样品编号 AHCZ CQSZ CQWX DPS FJFZ GDGZ GSLN GSTS GXGL GZXW HBHS HBTS HLD HLJSH HNHH HNNY HNSY HNXY JLBS JLTH
采集地 安徽省池州市 重庆市石柱土家族自治县
重庆市巫溪县 浙江省大盘山 福建省福州市 广东省广州市 甘肃省陇南市 甘肃省天水市 广西壮族自治区桂林市 贵州省贵阳市修文县 湖北省黄石市 河北省唐山市 辽宁省葫芦岛市 黑龙江省绥化市 湖南省怀化市 河南省南阳市 湖南省邵阳市 河南省信阳市 吉林省白山市 吉林省通化市
样品编号 JSNJ JXJA JXSR LNDD MDJ NMG NXYC SCJG SCLS SCYA SDQD SDZB SHFX SXXA SXYC YCXX YNWS YNYX YNZT ZJWZ
采集地 江苏省南京市 江西省吉安市 江西省上饶市 辽宁省丹东市 黑龙江省牡丹江市 内蒙古自治区鄂尔多斯市 宁夏回族自治区银川市 四川省广元市剑阁县 四川省凉山彝族自治州
四川省雅安市 山东省青岛市 山东省淄博市 上海市奉贤区 陕西省西安市 山西省运城市 山西省运城市夏县 云南省文山壮族苗族自治州
云南省玉溪市 云南省昭通市 浙江省温州市
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Table 2. ITS, rps16 and trnL-F sequence information of Allium download from NCBI 表2. NCBI下载的葱属的ITS、rps16及trnL-F序列信息
物种
棱叶韭Allium caeruleum Pall. 野韭Allium ramosum Linn. 合被韭Allium tubiflorum Rendle
北韭Allium lineare Linn. 多星韭Allium wallichii Kunth 韭Allium tuberosum Rottl. 镰叶韭Allium carolinianum DC. 黄花葱Allium condensatum Turcz. 宽叶韭Allium hookeri Thwaites 长梗韭Allium neriniflorum (Herb.) 单花韭Allium monanthum Maxim.
GenBank序列号
ITS MG772547 HQ690285 GU566622 GQ181103 HF934358 HE774705 AJ250290 HQ690573 KT762155 AJ411913 AJ412745
rps16 GU566645 HE774710 MG709296 GU566629 HF934473 GU566662 GU566627 GU566643 JX017639 KP207738 HF934413
trnL-F KF693263 KF143839 KF143837 KF693274 KF550178 KC139048 GU570982 JF262660 KF550163 JF262642 KF550166
Table 3. Primer and protocols of PCR 表3. PCR引物信息及反应程序
引物名称 ITS trnL-F rps16
引物序列
F: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG R: TCCTCCTCCGCTTATTGATATGC F: ATTTGAACTGGTGACACGAG R: CGAAATCGGTAGACGCTACG F: GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT R: TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC
反应程序
94℃预变性4 min；94℃变性1 min；55.6℃退火45 s；72℃延伸
1 min，共36个循环，最后72℃延伸7 min，4℃保存。 95℃预变性4 min；95℃变性45 s；52℃退火45 s；72℃延伸1 min，
共30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。 95℃预变性4 min；35 × (95℃变性30 s；53.4℃退火1 min；72℃延伸90 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。
2.3. 数据分析
测序所得数据采用Chromas软件查看序列峰图，利用DNAstar软件、MEGA7.0软件和PhyloSuite软件进行序列编辑和组装，校正错误碱基并对序列进行对位排序，去除引物区后对所得序列进行拼接[12] [13]。用最大简约法(Maximum parsimony, MP)和贝叶斯法(Bayesian inference, BI)进行系统发育分析并构建进化树。最大简约法中用自展值(Bootstrap value, BS)来检验系统发育树的可靠性[14]。使用MrBayes 3.2.1进行贝叶斯推理法分析，利用ITS + rps16 + trnL-F联合序列构建的系统发育树。用后验概率(Posterior probability, PP)表示分支可信度。
3. 结果与分析
3.1. ITS、rps16、trnL-F序列分析
本研究薤白的ITS、rps16及trnL-F序列均存在一定程度的变异(表4)，包括A-C、A-T、G-C、G-T间的碱基颠换及A-G、C-T间的碱基转换。包含由此可见，不同产区的薤白nrDNA和cpDNA序列均表现出一定的变异。
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Table 4. Information of ITS、rps16 and trnL-F 表4. ITS、rps16及trnL-F序列信息
序列名称 ITS rps16 trnL-F
平均长度(bp)
590 587 622
平均GC含量(%)
50.64 29.66 38.16
变异位点 342 4 12
简约信息位点
223 2 7
3.2. 薤白的亲缘关系分析
参考黄德青等[7]以单花韭(Allium monanthum Maxim.)为外类群，构建系统发育树(图1)。结果显示，中国地区的薤白单独聚为I组，其他葱属植物聚为II组，说明薤白为一单系种。第I组可分为位于中国西南地区的A组，如GZXW、SCJG、YNZT、SCLS、CQWX等地；位于中国沿海地区的B组，如GDGZ、DPS、SHFX、SDQD、LNDD等地；位于中国北方及东北地区的C组，如GSLN、YCXX、NMG、MDJ等地。II组中的A. wallichii Kunth与A. hookeri Thwaites聚为一支(PP = 1, BS = 99)；A. neriniflorum Herb.与A. tubiflorum Rendle聚为一支(PP = 1, BS = 100)；A. ramosum L.与A. tuberosum Rottl.聚为一支(PP = 1, BS = 100)。此外，II组中的A. caeruleum Pall.与薤白为一并系(PP = 1, BS = 100)，表明其相较于本研究所用的其他葱属植物与薤白亲缘关系较近。
4. 讨论
4.1. 序列特征
本研究中，中国不同产地薤白的ITS序列G + C平均含量为50.64%，包含342个变异位点；rps16序列G + C平均含量为29.66%，包含4个变异位点，存在于少数几条序列上；trnL-F序列G + C平均含量为38.16%，包含12个变异位点，同样存在于少数序列上。综上所述，rps16和trnL-F序列变异很小，信息位点不多，而薤白ITS序列含有丰富的变异位点和简约信息位点，说明ITS序列在中国地区的薤白中存在丰富的遗传变异，相比较而言，rps16与trnL-F序列的变异位点以及简约信息位点低于ITS序列，这与赵海光等[15]、陈仁芳等[16]及唐萍和彭程[17]的研究结果一致，体现了nrDNA ITS和cpDNA rps16与trnL-F序列在亲缘关系鉴定中的不同水平。使用ITS + rps16 + trnL-F联合序列能增加树长，提高信息位点，使拓扑结构更具有客观性，能较好的解决不同产区薤白的亲缘关系，可以为不同地区薤白的分类鉴定提供依据，具有一定指导意义。
4.2. 中国不同产地薤白的亲缘关系
中国地形地势西高东低，地形多种多样，地貌类型复杂多样。从西部的大高原，到中部的盆地，再到东部平原，自西向东呈阶梯状逐级下降的地势特点十分明显，自然环境存在较大的差异。本研究中，基于ITS、rps16与trnL-F联合序列构建的系统发育树，结果显示薤白与其它葱属植物区分开，单独聚为一支，支持将薤白作为独立的单系群。基于联合序列构建的系统发育树能够将40个不同来源的薤白划分为A (西南地区)、B (沿海地区)、C (北方及东北地区)三组。结合不同产地的地理位置来看，不同产地薤白的亲缘关系与其地理位置有关，如A组中包含的贵州修文、四川剑阁、云南昭通等地位于中国西南地区，该地区受青藏高原、云贵高原及四川盆地的影响，在地形地貌及气候环境方面表现出独特性；B组中包含的广东广州、浙江大盘山山东青岛等地为东部沿海地区，该地区受亚热带季风气候和温带季风气候的影响，降雨量高于内陆地区；C组甘肃陇南、山西运城夏县、内蒙古等地位于中国北方及东北地区，
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中国不同产地薤白ITS、rps16和trnL-F序列分析及亲缘关系分析 - 图文
