HPLC法测定昆明山海棠中雷公藤甲素含量

HPLC法测定昆明山海棠中雷公藤甲素含量

胡建林1,2,敖 琳1,宾 婕2,杨丽川2,刘晋祎1,曹 佳1*

【摘 要】摘 要:目的:建立高效液相色谱法测定昆明山海棠药材中雷公藤甲素含量的方法。方法:采用反相C18柱,以甲醇-水(49﹕51)为流动相,218 nm为检测波长,测定雷公藤甲素的含量。结果雷公藤甲素在0.044～1.1μg/m L范围内线性良好,r=0.9996,平均回收率为93.2%,RSD为1.97%。结论本方法灵敏、准确、重现性好。

【期刊名称】云南中医中药杂志 【年(卷),期】2010(031)007 【总页数】2

【关键词】关键词:高效液相色谱法;H PLC,昆明山海棠;雷公藤甲素;含量测定 昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum(Levl.)H utch.]系卫矛科(Celastraceae)雷公藤属[Tripterygium Wilfodii(H ook.)f.]植物,用于类风湿性关节炎,红斑狼疮等。昆明山海棠为中国特有植物,民间常用中草药。主要分布于我国西南地区,云南省境内尤为多见,资源丰富[1]。近年来,昆明山海棠有效成分研究多有报道,但其含量测定研究少见。2005年版《中国药典》(一部)示其片剂以重量法进行含量测定,测定方法相对粗糙,检测灵敏度、重现性有待提高。 高效液相色谱法是现今用于测定中草药中有效成分最好的方法之一,本项目对应用高效液相色谱法测定昆明山海棠中主要有效成分雷公藤甲素含量的方法进行研究,以期得到一种适用于昆明山海棠有效成分含量检测及药品质量控制的方法,完成昆明山海棠中主要有效成分雷公藤甲素的含量测定。

1 实验材料

1.1 仪器 日本岛津LC-2010A HT型 HPLC仪(LC-2010型四元泵,SPD-M 10A VP型二极管阵列检测器,自动进样器,LCSo lution色谱工作站),电子分析天平(德国赛多利斯),TU-1810型紫外-可见分光光度计(上海普析通用),SPE柱(Agilent TC-C18微柱)。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯,其他试剂为分析纯,雷公藤甲素标准品(上海标准品生物技术公司 批号 20505018含量≥98.0%)。

1.3 药材 昆明山海棠生药(购自玉溪药材公司,本院生药学教研室唐丽萍博士鉴定)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选定 雷公藤甲素对照品乙醇溶液,紫外-可见分光光度计200～400 nm扫描,最大吸收位置218 nm。

2.2 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18柱(4.6×250 mm,5μm),流动相:甲醇-水(49﹕51),流速:1 m L/m in,检测波长:218 nm,柱温:30℃,进样量:10μL。雷公藤甲素保留时间:16.80 min,对照品及样品色谱图,见图1。

2.3 对照品储备液的制备 精密称取雷公藤甲素对照品4.4mg,置10 m L容量瓶中,用无水乙醇溶解并定容,即得浓度为440μg/m L的雷公藤甲素标准储备液,置冰箱内低温保存,用时稀释为浓度44μg/m L的雷公藤甲素对照液。

2.4 样品处理 取昆明山海棠生药粉25 g,精密称定,置250m L锥形瓶中,用乙酸乙酯(120、60L、60 m L)回流提取 3次(3、1、1 h),过滤,滤液合并,回收溶剂至适量,过氧化铝柱[2](15 g中性氧化铝、100～200目、干法装柱),250 m L乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,水浴蒸干,转入25 m L容量瓶中,甲醇定容,过 SPE柱,作为样品溶液。

2.5 线性关系 取浓度44μg/m L的雷公藤甲素对照液,上述色谱条件下,分别进样 1、5、10、15、20、25 μL 测定,记录峰面积。以进样量X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,回归方程为 Y=103457X+5904.2,相关系数r=0.9996(n=6),表明雷公藤甲素含量在0.044～1.1μg/m L范围内线性良好。 2.6 精密度试验 取浓度44μg/m L的雷公藤甲素对照液10μL,上述色谱条件下,连续进样5次,RSD为2.56%,表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 取浓度44μg/m L的雷公藤甲素对照液,上述色谱条件下,8 h内每隔 1 h取 10μL进样,共 8次,RSD为2.63%。

2.8 加样回收率试验 取昆明山海棠生药粉 1 g,共5份,精密称定,各加入 44μg/m L的雷公藤甲素对照液1.0m L,按样品溶湘制备方法制备待测液,上述色谱条件下,分别进样,每次10μL,测定雷公藤甲素含量,平均回收率为93.2%,RSD为1.97%。见表1。

2.9 样品含量测定 精密称取昆明山海棠生药粉24.9456 g,按“2.4”项下方法制备样品溶液,上述色谱条件下,分别进样 3次,每次10μL,测定雷公藤甲素平均含量为37.80μg/m L,即得昆明山海棠生药中雷公藤甲素的含量为37.88μg/g,RSD为1.92%。

3 讨论

昆明山海棠所含成分复杂,甲醇提取后,极性杂质多,直接进样分离效果差,雷公藤甲素为二萜类化合物,脂溶性高,选用乙酸乙酯提取,氧化铝柱和SPE柱处理,可得到较好的分离和纯化。该方法重现性好,操作简便。雷公藤甲素是昆明山海棠治疗风湿性关节炎、红斑狼疮等疾病的主要有效成分,通过对昆明山海棠中雷公藤甲素的含量测定,可为昆明山海棠的合理应用及药材质量控制提供参考。