第一章 无菌操作技术实践 第1课时 微生物的培养和应用(Ⅰ)
【目标导航】 1.了解培养基及其种类和配制方法。2.掌握灭菌和消毒的区别与联系。 【重点提醒】 1.根据培养目的选择正确的培养基和培养基配制方法。2.常用的灭菌技术。
一、培养基的概念、种类
1．概念：为__________微生物而制备的、提供适合微生物________、______或积累__________的营养基质。
2．营养要素
微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是由C、H、O、N、P、S等元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。把这些化合物归纳成________、________、________和________等这几类营养要素。 营养含义 作用 主要来源 要素 构成生物体细胞的物质和无机化合物：CO2、NaHCO3；有碳凡能提供所需____一些代谢产物，有些是异养机化合物：糖类、脂肪酸、花生源 元素的物质 生物的能源物质 粉饼、石油等 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝氮凡能提供所需____合成蛋白质、核酸以及含氮酸盐；有机化合物：尿素、牛肉源 元素的物质 的代谢产物 膏、蛋白胨等 在生物体内含量很不仅是良好的溶剂而且可 水 高，在低等生物体维持生物大分子结构的稳 内含量更高 定 无为微生物提供除细胞内的组成成分，生理调机碳、氮元素以外的节物质；某些化能自养菌的 物 各种重要元素 能源，酶的激活剂 说明 关于碳源和氮源
(1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 (2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。
3．培养基的种类 划 分培养基用途 特点 标种类 准 ______ 不加凝固剂 工业生产 培养基 物______ 加少量凝固剂 观察微生物的运动、 理 培养基 分类、鉴定 性______ 加凝固剂，如琼脂 微生物分离、鉴定、 质 培养基 活菌计数、保藏菌种 ______化含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基 学 ______培养基成分______(用化学成分已成 培养基 知的化学物质配成) 分
______培养基 用途 ______培养基 培养基中加入某种化学物质，以______不需要微生物的生长，________所需要微生物的生长 培养、分离出特定微生物 (如加富培养基中培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素或链霉素；培养固氮菌可用无氮培养基，如阿须贝培养基) ________不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落带有绿色金属光泽) 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种________或____________ 二、消毒与灭菌 1．在微生物培养时获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵
无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括四方面的内容： (1)对实验操作的________、操作者的________和____进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的________、____________和________等器具进行灭菌。 (3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在________________进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
提醒 实验后，所有用过的培养基、培养液等都要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，否则会造成环境污染。实验过程中一定不可吃东西、喝水。离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。
2．比较消毒与灭菌 条件 消毒 灭菌 较________的物理或化学方法 ______的理化因素 结果 仅杀死物体____________对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) ______________________，包括________和________ 常用方法 ________消毒法(如100℃，5～6 min可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢)、________消毒法、____________消毒法 ________灭菌、________灭菌、____________灭菌、________除菌 3.高压蒸汽灭菌 (1)原理：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内；把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。
(2)设备：主要是____________________，实验室中以手提式最为常用。 (3)使用方法
①加水：使用前在锅内加入适量的水。 ②________：装入待灭菌的物品，不能太满，盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺栓，打开排气阀。
③____________：加热待水煮沸后，使蒸汽和空气一起从排气孔排出。
④保温保压：当压力表指针指到121℃时，调节热源，使压力维持不变，并开始计算灭菌时间，根据灭菌的物品确定灭菌时间。
⑤出锅：当压力表中指针降至________，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物品。
提醒 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌。灭菌完成后要等压力表中读数为“0”后，先放气再打开灭菌锅盖。
三、细菌培养基配制的操作流程 1．培养基的配制原则
(1)________________(根据微生物的种类、培养目的等)，如生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。
(2)营养要________，注意各种营养物质的浓度和比例。 (3)________要适宜，各种微生物适宜生长的pH范围不同，细菌6.5～7.5、放线菌7.5～8.5、真菌5.0～6.0。
2．配制流程
? ↓
? ：0.5 g牛肉膏＋1 g蛋白胨＋0.5 gNaCl? ＋1.5 g琼脂? ↓
100 mL蒸馏水
??烧杯＋
↓微火加热、不断搅拌?培养? ?溶化后加琼脂
基的 ↓??配制?熔化后，补水至100 mL
?? ――→
? ：趁热分装到洁净试管中，培养基的高? 度约为试管高度的1/5
――→?
? ：外包牛皮纸，且挂标签
计算
：3%的HCl或NaOH将pH调为 7.0 ～7.2
加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水
?
? ：竖放于灭菌桶中，不要太挤?
：排气软管插入排气槽，同时? 旋紧相对的两个螺栓?
?排冷空气：打开排气阀，排除锅内冷空气
? ：关上排气阀，压力升至100 kPa，? 温度为121 ℃，维持20 min?
取出灭菌物品：断电后，压力降至0时，打? 开排气阀，旋松螺栓，取出? 灭菌物品
注入开水：与底架平齐
搁置斜面：待试管冷却至50 ℃左右，搁置在合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面
不超过试管总长的________
知识点一 培养基的概念、种类 【例1】 下列说法正确的是( )
A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 B．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 C．除水以外的无机物只能提供无机盐 D．无机氮源不可能提供能量 答案 A
解析 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。
规律链接 (1)病毒没有独立的生命，依靠活细胞才能生活，普通培养基不能用来培养病毒。常用于培养病毒的是活鸡胚。
(2)培养基种类繁多，应根据微生物的种类和实验目的，明确培养基的特定用途，选用合适的培养基。
(3)自养微生物和异养微生物的营养区别 微生物营养型 自养型微生物 碳源 CO2、NaHCO3 氮源 铵盐、硝酸盐等 举例 硝化细菌
异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 乳酸细菌 变式训练1 要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用( ) A．固体培养基 B．液体培养基
C．加青霉素的培养基
D．加入高浓度食盐的培养基 知识点二 消毒与灭菌
【例2】 培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是( )
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤ 答案 A
解析 培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。
规律链接 常见的消毒方法：(1)日常生活经常用到的是煮沸消毒法；(2)对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；(3)对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；(4)实验操作者的双手使用酒精进行消毒；(5)饮水水源用氯气进行消毒。
变式训练2 下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( ) A．防止杂菌污染 B．消灭杂菌
C．培养基和发酵设备都必须灭菌 D．灭菌必须在接种前 知识点三 培养基的配制
【例3】 下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( ) A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C．待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板
D．待平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置 答案 A
解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，再用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至50 ℃左右时，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时倒平板。平板冷却凝固约5～10 min后还需倒置。
规律链接 (1)不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。
(2)营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为4∶1时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大增。
变式训练3 若在牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，对这一说法不正
第一章无菌操作技术实践苏教学案
