本技术涉及一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括：对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应标准参照品特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品中各活性成分的含量及活性成分组的含量。本技术可以反映金银花中含有哪些金银花有机酸或/和环烯醚萜苷类化合物以及它们之间的比例，达到对金银花药材品种和质量鉴定的目的。
技术要求
1.一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1）对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；
2）对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物分别进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述金银花有机酸或/和环烯醚
萜苷特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品中各有机
酸或/和环烯醚萜苷类活性成分的含量及该两类活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征
提取物的提取方式。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取金银花药材或饮片进
行粉碎，加入20～25%乙醇回流提取或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，减压蒸干，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；所述金银花药材或饮片与20～25%乙醇的质量体积比为1：(6～10)；所述大孔吸附树脂的重量为浓缩后的滤液重量的1～2倍；所述回流提取的温度为90～95℃，超声提取的温度为50～60℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70；所述大孔吸附树脂的径高比为8
～15：1。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，对金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱
检测，溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的溶剂为氘代氯仿、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为酯羰基吸
收峰，其化学位移为δC164.0～167.0或δC168.0～170.0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若
干个活性成分进行排序。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述定量分析手段为高效液相法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述高效液相的条件包括：流动相为乙腈：0.4%磷酸溶液=(10～20):(80～95)，优选13：87；检测波
长为240nm。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质
量百分含量。
11.根据权利要求1～10任意一项所述的方法，其特征在于，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为绿原酸。12.根据权利要求1～11任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；M1为所述金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；Wn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度。
13.根据权利要求1～12任意一项所述的方法，其特征在于，所述金银花衍生品包括：金银花饮片、金银花提取物或金银花天然药物。
技术说明书
一种鉴别金银花药材或衍生品的方法技术领域
本技术属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别金银花药材或衍生品的方法。背景技术
金银花（Lonicerae japonicae flos）是忍冬科植物忍冬（looonicerajaponica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，为我国著名的中药材。金银花归肺、心、胃经，
效[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部.中国医药科技出版社，205]。其活性成分主要为有机酸、环烯醚萜苷和黄酮类化合物，具有抑菌抗病化作用等作用[①张守平，等.中国中医药信息杂志2007，14(3):84.②王力川.安徽农业科学2009，37(5):2036.]。
定性鉴别上述某类活性成分或定量测定某种活性成分含量，已成为评价金银花及其制剂质量的重要方法。但这种针对单一成分进行定性、定量分析的质量检足当前对于客观有效地评价和控制金银花及其制剂质量的迫切要求。
指纹图谱技术是目前国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法。人们凭借实用的指纹图谱不仅可确认该产品的真伪，同时能评价其质量。目前，金
HPLC指纹图谱[①白雪梅,等.中成药2004,26(7):521.②熊艳,等.中国中药杂志2009,34(8):1015.]、毛细管电泳指纹图谱（HPCE法）[孙国祥,等.色谱2007,25(1):96.
等.中国中药杂志,2012,37(23):3564.]等。其中主流方法HPLC指纹图谱由于受非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流
度等）影响较大和多组分定量需用多个标准品等等原因，重复性和可行性均存在许多局限性；HPCE法虽以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC
较低等不足；单一LC-MS分析方法由于中药复方的复杂性和缺乏标准品的现状，MS还有离子化程度和基质干扰等问题，通常不足以对多种成分进行准确的结
IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13C NMR coupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，该技术是在已研究多年的核磁共振氢谱（
新的非单一手段综合指纹图谱技术。目前为止，鉴别金银花药材或衍生品，利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术并未见相关报道和技术内容的披露。
纹法鉴定植物中药，中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等，中药色谱指
金银花的品质不在于某个单一成分，其疗效是多个成分协同配比的结果。因此，建立不仅能控制金银花活性成分，而且能控制这些活性成分之比例的IGD核磁
或衍生品核磁共振碳谱偶联指纹图谱的研究与应用，不仅可以解决我国金银花药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强金银花药材或衍生品内在成分研究的保证。随着该技术在其他中药材或衍生品中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。技术内容
为了解决现有技术的问题，本技术的目的在于提供一种鉴别金银花药材或衍生品的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。为了实现上述目的，本技术提供的鉴别金银花药材或衍生品的方法，包括以下步骤：
1）对金银花药材或衍生品进行提取，得到含有活性成分组（有机酸或/和环烯醚萜苷）的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物；
2）对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物
（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出金银花药材或衍生品
及主要活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的提取方式。
其中，步骤1）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的制备方法，包括：称取金银花药材或饮片进行粉碎，加入20～25%乙醇回流提取或超声提取2减压浓缩；取浓缩后的滤液，用大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，减压蒸干，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物。进一步地，所述金银花药材或饮片与20～25%乙醇的质量体积比为1：(6～10)（g:mL）。进一步地，大孔吸附树脂的重量为浓缩后的滤液重量的1～2倍。
进一步地，所述回流提取的温度为90～95℃，超声提取的温度为50～60℃。进一步地，金银花药材或饮片粉碎后过24～65目筛。
进一步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70。进一步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1，优选10～12:1。
其中，步骤2）中，对金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的溶剂
（CD3COCD3）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），优选氘代甲醇。金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物与相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1（mg：m
除金银花饮片外，其他金银花衍生品，如金银花有机酸或/和环烯醚萜苷提取物可直接作为金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物，用上述方法进行鉴别。其中，步骤2）中，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分特征峰为酯羰基吸收峰，其化学位移为δC164.0～167.0（用氘代DMSO-d6
δC168.0～170.0（用氘代甲醇溶解金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物时）。
其中，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中若干个活性成分进行排序。
进一步地，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分：绿原酸、绿原酸丁酯、Vanillic ac丁酯+3，4-O-双咖啡酰基奎宁酸乙酯、阿魏酸、咖啡酸乙酯、α-莫诺苷+Secologanin dimethyl acetal、β-莫诺苷、獐牙菜苷、金吉苷进行排序。其中，步骤2）中，所述峰强度可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC）法。
进一步地，当检测金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物时，所述高效液相的条件包括：流动相为乙腈：0.4%磷酸溶液=(10～20):(80～95)，优选13：87；其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的标准参照品的质量百分含量。进一步地，金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的活性成分的标准参照品为绿原酸。其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；M1为所述金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；Wn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为金银花药材或衍生品中某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的金银花药材或衍生品中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和
上述公式的推导过程为：
本技术方法所述活性成分组，既可以是金银花单味药材中的活性成分组，也可是金银花衍生品中的活性成分组。所述金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取醚萜苷类活性成分，活性成分组即指相应同类活性成分的总和。
其中，所述金银花衍生品包括：金银花饮片、金银花提取物（如金银花有机酸提取物、金银花环烯醚萜苷提取物或金银花黄酮提取物，或者它们中两种或两本技术所述的金银花药材，包括金银花植物的各个部位，如根、皮、茎、叶、花和果实等。
本技术各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本技术采用IGD
①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；
IGD核磁共振碳谱指纹图谱只能表明特征提取物中有哪些活性成分，以及这些活性成分之间的定量比例，而这些活性成分的绝对含量必须通过标准参照品和其
本技术的优势在于：
1、本技术中的四个步骤是一个整体，缺一不可；四个步骤都有各自的独到之处；如若分开或简单组合则不能检测药用植物中复杂成分的比例和含量。
众所周知，虽然中药、植物源农药是历史悠久的药物，但其分析检测一直是个难题。因此，特别需要一种方法能够鉴别植物品种及其提取物中的各种
分或其组合物，以便充分发挥其效果。另外，中药、植物源农药走出国门的障碍之一是没有组成成分及其定量标识，原因即为目前现有技术解决鉴别植物品
存在着很大的局限性（具体见本申请背景技术描述的内容）。事实证明，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术正是解决这个问题的关键技术，这已在本申请的
2、虽然常规提取工艺为普通技术人员所熟知，但却从未有人将得到清晰图谱和具有代表性的活性成分组作为标准来选择工艺参数得到特征提取物。利用此方
是本技术的难点之一，也是本技术的创新点之一。
3、IGD13C NMR偶联指纹图谱是多个活性成分的混合谱，不可避免会引起一根根棒峰的拥挤，甚至重叠。为了使计算结果准确，选择化学位移差别较大的
的。由于不同类型化合物碳谱差别很大，特征峰的选择可以千变万化；相同类型化合物碳谱差别很小，很多谱峰重叠严重，需有深厚的核磁共振波谱知识指
征峰；而特征峰选择不好，是没有办法对活性成分组进行准确定量分析的，这也正是本技术需要解决的问题。根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的所以，根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰也是本申请的又一创新点。
4、由于特征峰化学位移差别很小，很多情况下，仅在小数点后第1位差别，所以特征峰的排序是确定主要活性成分及其比例的关键，没有深厚的核磁共振波
本技术的创新点之一。
性成分及其比例，也就无法对活性成分组进行准确定性定量分析，根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的碳谱核磁数据的特点，对两类成分的特征峰
5、偶联计算关键是选择标准品和定量分析技术的选择。分析定量手段可以选择高效液相、气相色谱、薄层色谱法和称量法等，标准参照品可以是某一
根据金银花中绿原酸类和环烯醚萜苷类成分的特点，分析定量手段选择的为液相，标准参照品选择的是绿原酸。这是技术的难点之一，也是本技术的创新点本技术所涉及的研究项目受质检公益性行业科研专项经费资助项目（项目编号：2012104019-1）。
本技术采用IGD核磁共振碳谱指纹图谱对金银花药材或衍生品进行鉴别，可以反映金银花药材或衍生品中含有哪些金银花活性成分以及它们之间的比例，达到
的。线性范围宽，灵敏度高，重复性和可行性好。不仅能够有效控制金银花药材或衍生品的内在质量，也可以满足当前对于客观有效地评价和控制金银花质银花药材或衍生品鉴别和评价的难题，也为加强金银花药材或衍生品内在成分研究的系统化与标准化，实现与国际接轨提供了科学的保证。附图说明
图1-a为实施例1市售金银花药材A有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为实施例1市售金银花药材A有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。图2-a为实施例2市售金银花药材B有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为实施例2市售金银花药材B有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。图3-a为实施例4市售绿原酸20%金银花提取物（上禾）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为实施例4市售绿原酸20%金银花提取物（上禾）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。图4-a为实施例5自制金银花提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-b为实施例5自制金银花提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。具体实施方式
以下实施例用于说明本技术，但不用来限制本技术的范围。
若未特别说明，本技术中使用的物料均为本领域的常规物料，未提及的操作方法也为本领域的常规方法。本技术中，甲醇和乙醇的浓度均为体积百分数。一、金银花药材或衍生品IGD核磁共振碳谱指纹图谱研究
（1）由金银花药材或衍生品提取得到的金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的获得
①从金银花药材或饮片中获得
称取金银花药材或饮片粉碎（过24～65目筛），加入体积为6～10倍量、20%～25%（体积比）的乙醇于90～95℃下回流或50～60℃下超声提取2～3次，每次
浓缩后的滤液，用其重量为1～2倍量的大孔吸附树脂装柱，以水-乙醇体系冲柱，收集不同洗脱部分，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物（CET）所述大孔吸附树脂型号为HP-20、D-101、D-201、SP-825或SP-70；所述大孔吸附树脂的径高比为8～15：1，优选10～12:1。②从其他金银花衍生品中获得
直接取其他金银花衍生品（除金银花饮片外的金银花衍生品，如金银花有机酸或/和环烯醚萜苷提取物）作为金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物。
2）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物，溶于氘代氯仿、DMSO-d6或氘代甲醇中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得金银花有机酸或/和环烯醚萜金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物与相应溶剂的质量体积比为55:1～65:1（mg：mL），优选60:1。
3）金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
①鉴别
金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物（CET）IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示金银花有机酸或/和环烯醚萜苷类化合物的特征信号。②金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中的各活性成分特征峰选取
根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰。选择原则如下：①同类化合物的指定特征峰最好为各个化合物位置相同的碳碳峰；②每差别较大；③各个化合物的指定特征峰之间化学位移差别较大；④影响各个化合物的指定特征峰本身的化学位移效应差别较大。
由于金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中含有一系列该类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大相应峰
基碳碳峰作为两类活性成分碳峰指定特征峰，其原因为酯羰基碳与其他碳化学位移差别较大，易识别；且不同化合物羰基碳碳峰之间化学位移也有一定差别③标准参照品的选择
绿原酸是金银花有机酸或/和环烯醚萜苷特征提取物中主要活性成分之一，其羰基化学位移与其他主要成分在此没有重叠；因此，选择绿原酸作为标准参照品
4）采用HPLC法测定金银花药材或衍生品中绿原酸的含量i）色谱条件（参照2010版药典）
流动相：乙腈：0.4%磷酸溶液=13：87；色谱柱：C18（250*4.6mm，5um）；
鉴别金银花药材或衍生品的方法与相关技术
