（1）. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制（质粒DNA载体）。如：质粒载体 （2）. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒。如：噬菌体载体
（3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。如：柯斯质粒载体
用于原核生物宿主的载体目前已构建应用的基因工程载体主要有： 质粒载体、 噬菌体载体、 柯斯质粒载体。 （一）.质粒（plasmid ）：质粒是细胞染色体或核区DNA外能够自主复制的很 质粒载体特点
1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。
3、 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ?注：前三个特点必不可少。 1、 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 2、 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr）
2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） 3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr）
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
三 DNA重组基本程序
1.分—载体和目的基因的分离 2.切—限制性内切酶的应用
3.接—载体与目的基因连接成重组体 4.转—基因序列转入细胞
5.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 6.表－目的基因在宿主细胞的表达
目的基因的获取方法：从基因组中提取、CDNA法、化学合成法、PCR法。
鉴定得到的目的基因的鉴定方法：抗性选择、提取质粒电泳鉴定大小、快速提取酶切鉴定、菌落杂交法、DNA序列分析。 第二节 分子杂交及相关技术
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分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.
分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交），DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western 杂交）等。 一、杂交探针（Probe）的获得
Probe：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记后，能与目的基因片段特异性杂交的已知序列的核酸片段。
根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 ? DNA探针：
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 可从已建立的基因组文库中筛选分离并克隆制备。 ? cDNA探针（complementary DNA） ：
cDNA是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。
可以从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。 ? RNA探针：
RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。 ? 寡核苷酸探针：
根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bp RNA探针和cRNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。前三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。 三、DNA杂交常用的方法
用途：用于快捷地检查出菌落中是否有某个基因，但不能检出基因的大小或重复的程度 。
（二）. Southern DNA印迹杂交
? 将重组体DNA用限制酶切割，分离出目的DNA后进行电泳分离，再将其原位转至薄膜上，固定后用探针杂交的方法叫Southern杂交。
? 用途： 用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，而且还可知道其大小及酶切位点的分布。
Southern DNA印迹杂交主要步骤：
1. DNA提取，限制性内切酶切割成DNA片段。 2. DNA电泳。
3. 印迹，将进行DNA电泳的凝胶置于印迹设备中，缓冲液内含有碱，在印迹过
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程中DNA变性，变成单链DNA。凝胶上的DNA分子通过毛细管作用或电导作用被原封不动地―吸印‖到滤膜上。
4. 80℃烘烤1-2小时，DNA片段牢固结合到膜上。
5. 带有DNA的滤膜与杂交探针一起温育，探针与DNA结合。洗去没有结合的游离探针。
6. 用X光底片曝光后所得的放射性自显影图片，同溴化乙锭染色的凝胶谱带进行对照比较，便可鉴定出那一条限制片段是与探针核苷酸同源的。 （三）.菌落印迹原位杂交(in situ hybridization)
让含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到膜上并释放出DNA，变性并固定在膜上，再同DNA探针杂交的方法叫原位杂交。
用途：用于在转化菌落中筛选带有目的基因的重组克隆 四、RNA杂交常用方法
Northern RNA 印迹杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法，被检对象为RNA,探针为DNA或RNA.
用途：用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录 。
原理及步骤：提取总 RNA、提纯分离mRNA 、琼脂糖凝胶电泳分离RNA、转移至硝酸纤维素膜、杂交检测 关于印迹技术的概念
印迹是将DNA、RNA或蛋白质固定在固体支持物的过程。
印迹的目的是减少待测物质的流动性，防止丢失、扩散，保持原有的位置，便于反复使用，容易进行斑点和序列分析，简化分离手续。
Southern杂交、Northern杂交和Western印迹、Eastern印迹实际上都是印迹技术。但印记转移的目标物质不同，鉴别方法也不同。 五、蛋白质印迹法（Western bloting)
Western blotting分析(p189)
是蛋白质分析的技术在基因表达研究中，应用非常广泛，因为蛋白质是基因的产物，研究蛋白质的变化来分析判断基因转录的高与低。
步骤：细胞→提取总蛋白质→聚丙烯酰胺凝胶电泳→转膜（Western blotting，常用醋酸纤维膜）→固定→用化学发光试剂标记（抗体抗原反应） →分析相对量以判断表达量的多少。
第三节 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
体外程序化的DNA合成技术。
1.增效PCR（booster PCR）2. 巢式PCR（nest PCR）3、多重PCR4、 逆转录PCR (retro-transcription PCR，简称RT PCR) 5.不对称PCR6.反向PCR7、锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）
? 先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3‘-可变区末端加上一个PolyG
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尾巴，所用引物是具5‘-polyC尾巴，可以与PolyG尾巴结合，是一个固定点，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，由此进行PCR扩增，叫锚定PCR 。 ? 锚定PCR主要用于分析具有可变末端的DNA序列. ? PCR技术的应用
1.遗传性疾病的基因诊断2.传染病的诊断(肝炎病毒)3.癌基因检测4.法医学(亲子鉴定)上的应用5.DNA测序6.基因克隆7.引入基因点突变,基因融合等 第四节 DNA多态性（DNA Polymorphism ）
群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常用做遗传分析中的标记。
除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。 DNA多态性有两类： 1.位点多态性：
是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。
突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 2. 序列长度多态性：
? 又称可变数目变异串联重复序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），重复序列以各自的核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。
? VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。
PCR-SSCP(Single-Stranded Conformation Polymorphroism)
SSCP ：单链构象多态性
是指单链DNA由于碱基序列不同而引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 基因芯片，又称生物芯片，DNA芯片，DNA探针微阵列（Micro array）。它集成了大量的密集排列的基因探针，这些探针位于芯片的特定位点上，可与被荧光标记的若干靶核酸序列互补匹配，利用基因芯片杂交图象，可以确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列，实现核酸序列的分子识别。基因芯片能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。 1.基因组扫描 2.寻找基因功能
3.基因型及单碱基多态（SNP） 4.突变检测 5.基因表达 6. 基因测序 7.药物筛选
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几乎所有的生物学研究领域。作为一种高通量的基因检测方法，具有巨大的应用潜力。 第六章 原核生物基因表达调控
一、 基因表达 (gene expression)：在一定调节机制控制下，基因通过转录和翻译而
产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程 。
? 大多数基因的表达产物是蛋白质,部分基因如tRNA和rRNA基因表达产物是RNA。
二、基因表达调控
? 围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表达调控. ? 转录水平的调控 ? 转录后的调控 ? 翻译水平的调控
DNA水平包括基因丢失、基因重排、染色质的结构状态。 RNA水平包括转录水平调控、RNA的转录后加工、mRNA从核内向胞浆转动、mRNA稳定性。
蛋白质水平包括翻译过程；翻译后加工的蛋白质的稳定性。 三、基因表达的特性：
1）时间特异性或阶段特异性 2）空间特异性或组织细胞特异性 1、时间特异性
按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性(temporal pecificity)。
多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。 ? 2、空间特异性（spatial specificity）:
? 在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。
? 基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。 四、基因表达的方式 ? 组成性基因表达
? 适应性表达（诱导和阻遏表达） 1、组成性基因表达
? 指不大受环境变动而变化的一类基因的表达。如：DNA 聚合酶、RNA聚合酶等代谢过程中十分必须的蛋白质或酶的表达。
某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因 (house-keeping gene)。如：微管蛋白基因、糖酵解酶系基因、核糖体蛋白基因等。 2、适应性表达（诱导和阻遏表达）
指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。
? 诱导表达（induction）指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。
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分子生物学课件重点整理 朱玉贤
