制运输 蛋白质在游离核核、叶绿体、线粒体、 细胞器糖体上合成，以翻乙醛酸循环体、过氧发育 译后运转机制运化物酶 输 体等细胞器中的蛋白质 膜的形两种机制兼有 质膜、内质网、类囊成 体 中的蛋白质 1、翻译-运转同步机制 信号肽假说
●信号肽：能启动蛋白质运转的任何一段多肽。（常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端））。 ●绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽。 ●信号序列特点：
（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；
（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；
（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。 ●信号肽假说内容：
（1）蛋白质合成起始首先合成信号肽
（2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停
（3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始 （4）信号肽进入膜结构
（5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行 （6）蛋白质完全过膜，核糖体解离 信号肽与蛋白质转运的关系P144
（1）完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件； （2）仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生； （3）信号序列切除并不是转运所必需；
（4）并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽。 蛋白质翻译运转同步运输的基本过程 可分两个阶段：
首先：带有新生肽链的核糖体与膜结合； 然后：新生肽链进入膜通道并易位。
核糖体与膜结合需要信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）。 SRP有两种能力：
◆结合新合成的分泌型蛋白的信号序列；
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◆结合位于膜上的 SRP 受体。 2、翻译后运转机制 前导肽及其特性:
? 翻译后跨膜易位的蛋白质，前体一般含前导肽(leader peptide)，前导肽在跨膜运转中起重要作用。
? 过膜后，前导肽水解，蛋白质变为有功能的蛋白质。 前导肽的一般特性：
（1）带正电荷碱性氨基酸（Arg）较丰富， 分散于不带电荷的氨基酸序列之间； （2）缺少带负电荷的酸性氨基酸； （3）羟基氨基酸（Ser）含量较高；
（4）有形成两亲（亲水和疏水）α- 螺旋能力。 线粒体蛋白质跨膜运转 ? Hsp70为分子伴侣
? 分子伴侣：结合在一些不完全装配或不恰当折叠蛋白上，帮助它们折叠或防止它们聚集的蛋白质。 ? 分子伴侣的生物学功能
? (1)帮助新生蛋白质正确折叠 ? (2)纠正错误折叠或介导其降解
? 泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme，E1) ? 泛素结合酶（ubiquitin - conjugating enzyme，E2) ? 泛素蛋白连接酶(ubiquitin -proteinligating enzyme, E3) E1,E2,E3的作用：
? E1激活泛素分子，
? E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。 ? E3能识别被降解的蛋白质。
第五章 分子生物学研究法 ﹡重组DNA技术-基因工程 ﹡分子杂交及相关技术
﹡聚合酶链式反应的原理和应用 ﹡DNA多态性及其检测
? 基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。
? 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 ? 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。 1、理论上的三大发现
? 遗传物质主要是DNA
? DNA的双螺旋结构和半保留复制机制
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? 遗传密码子的破译 2、技术上的三大发明
? 限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片断 ? 质粒改造成载体以携带DNA片断克隆 ? 逆转录酶的使用 ①常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 ②载体 vector ? 自我复制
? 克隆载体、表达载体
原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13） 真核载体：动物病毒载体pLXSN 载体的条件 ? ? 分子小（? 10 Kb） ? ? 有限制酶酶切位点 ? ? 可自主复制 ? ? 有足够的copy数 ? ? 带筛选的标志 1982年 -- 转基因小鼠 1997年 克隆绵羊―多利‖ 1998年 -- 克隆鼠
2001年2月 -- 人类基因组
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。
这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。
基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。
基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。或者说基因操作技术服务于基
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因工程。 一、限制酶
限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（―分子手术刀‖）。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名
命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号
EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。
2、限制酶的特点：
（1）. 限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点： ① 能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；
② 两条互补链的5‘—3‘的序列组成相同，即将一条链旋转180度，则两条链重叠。 （2）. 识别４-8个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列。 （3） 切割方式有两种
① 错位切割，产生互补性的粘性末端。
错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。
② 沿对称轴切割，产生平齐末端
切割后，DNA末端的一条链多出一至几个核苷酸，成为突出末端，又称粘性末端包括3‘突出、5‘突出。
切割两条链时产生两端平整的DNA分子，称为平末端。 （4） 具有同裂酶
来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。 如：BamH I和Bst I具有相同的识别序列GGATCC。 （5） 具有同尾酶
来源各异，识别的靶序列也不同，但却产生相同的黏性末端，故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来，但一般不能再被原来的任何一种酶所切割。
如：Taq I、Cla I和Acc I为一组同尾酶，其中任何一种酶切割DNA分子都产生5′端CG凸出的粘性末端。 二、目的基因及载体 （一）目的基因
（一）目的基因的获得 1）化学合成法：
较短的基因（60-80bp）
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用途：PCR引物、测序引物、定点突变、核酸杂交探针 1）DNA 的化学合成
单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术。 ? 化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5‘端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。
? 整个DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。
? 目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法。 2）基因组文库和cDNA 文库
基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA library) 是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。
将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的―图书馆‖中查找（没有目录）。
cDNA文库 首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。
cDAN文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。
组建一个cDNA文库的步骤： 1)分离表达目的基因的组织或细胞
2)从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA
3）第一条cDNA链的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆转录酶，4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。 4)第二条cDNA链的合成
5) cDNA的甲基化和接头的加入 6)双链cDNA与载体的连接 （二）载体
载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 载体具以下特征：
1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；（质粒大于15kb时，其将外源DNA转入大肠杆菌的效率将大大降低。） 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；
3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。
4）可以在载体细胞中独立复制，即本身是一个复制子。 基因工程载体的分类
根据载体的分子生物学特性划分
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分子生物学课件重点整理 朱玉贤
