逆境生理指标的测定
要求：选三个指标
一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定
催化下列反应： 2 2 ● +2H+ → H2O2 + O2 O2●O反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
原理
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm处有最大吸收，而SOD可清除 从而抑制了蓝O2●O2●O2●色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计
算出酶活性大小。
试剂
0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；
130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；
750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存； 100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml；
20μmol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml避光保存(当天配制)。
方法
1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应 取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。
表1 各溶液加入量
试 剂（酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 用量(ml) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 3.0 终浓度（比色时） 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 对照管加缓冲液代替酶液 3、蛋白浓度的计算 蛋白浓度＝
c?v 单位：mg蛋白/g样重 a?W c－通过标准曲线查得的每管中蛋白含量（mg） v－样液总体积（ml）
a－测定时提取液体积用量（ml） W－样重（g）
4、SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。
SOD总活性 =
(Ack?AE)?V 单位：酶单位/g鲜重表示；
Ack?0.5?W?aAck―照光对照管的光密度值； AE—样品管的光密度值； V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）； W—样重（g）；
二、氧自由基的测定
原理：
O2●与羟胺反应生成NO2- ，NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，染料在λ530nm有显著吸收，根据OD530可以算出样品中的 O 2 ●含量。
步骤：
1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。
2亚硝酸根标准曲线的制作：1ml系列浓度的NaNO2(0、5、10、15、20、30、40和50mol /L)分别加入l m1对氨基苯磺酸和lmlα-萘胺，于25℃中保温20min，然后测定OD550，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线。
3 O2-含量测定：0.5m1样品提取液中加入0.5m150mmo1/L磷酸缓冲液(pH7.8)，1m1的1mmo1／L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温l h，然后再加人l m117mmo1/L对氨基苯磺酸(以冰醋酸：水＝3：1配制)和1m1 7mmol/Lα-萘胺(以冰醋酸：水＝3：1配制)，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。
●2的反应式： 根据测得的OD530，查NO2—标准曲线，将OD530换算成[NO2-]，然后依照羟胺与 O NH2OH
十2O2十H+ NO2-十H2O2十H2O从[NO2-]对[O2]进行化学计量，即将 [NO2-]乘以2，得到[O2]根据记录样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，可求得产生速率(nmo1min-1mg-1蛋白)。
三、植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
原理
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。
试剂
3%磺基水杨酸水溶液；甲苯；
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3d有效；
脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。
方法
1．标准曲线制作
（1）取7支具塞刻度试管按表1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。
（2）取出、冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以
“0”管为对照在波长520nm下比色。
表1 各试管中试剂加入量
管 号 标准脯氨酸量(ml) H2O(ml) 冰乙酸(ml) 显色液(ml) 脯氨酸含量(μg)
0 0 2.0 2.0 3.0 0
1 0.2 1.8 2.0 3.0 2
2 0.4 1.6 2.0 3.0 4
3 0.8 1.2 2.0 3.0 8
4 1.2 0.8 2.0 3.0 12
5 1.6 0.4 2.0 3.0 16
6 2.0 0 2.0 3.0 20
（3）以光密度值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 2．样品测定
（1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀叶片0.2~0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。
（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min。
（3）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层，以空白管为对照，在波长520nm下比色测定。
（4）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数： 脯氨酸（μg/g FW或DW）=(C×V/a)/W
式中 C—提取液中脯氨酸含量（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取提取液的体积（ml）； W—样品重（g）。
注意事项:
样品测定时若气温较低,萃取物分层不清晰,可将试管置于40℃左右的水浴中快速测定。或过夜静置。
四、植物组织中丙二醛含量的测定
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反应植物遭受逆境伤害的程度。
原理
丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的光密度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100~300μg/g DW，根据植物样品量和提取液的体积，加＋入Fe3的终浓度为0.5μmol/L。
双组分分光光度计法
根据朗伯-比尔定律：D＝kCL，当液层厚度为1cm时，k=D/C，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的光密度值等于此混合液在该波长下各显色物质的光密度之和。
已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40，7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：
C1(mmol/L)=11.71D450 ② C2(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 ③
式中：C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度，D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。
试剂
10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠（1 mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。
方法
1. 实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
2. MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆在4000rpm离心10min，上清液为样品提取液。 3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml（空白加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的光密度。 4. 计算含量
双组分分光光度法 按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。
用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：
?提取液体积（ml）MDA(μmol/g FW)＝MDA浓度（μmol/L）
植物组织鲜重（g）五、植物组织中过氧化物酶活性测定
原理
在过氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最大光吸收, 故可通过测 470nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 步骤：
1. 酶液的制备：取 1.0-5.0g 材料，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于 3000g 离心 l0min，上清液转入25ml 容量瓶中。沉淀用 5ml 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。
2. 过氧化物酶活性测定：酶活性测定的反应体系包括：2.9ml0.05mol.L-l 磷酸缓冲液；1.0m1 2%H2O2；1.0ml 0.05mol.L-l 愈创木酚和 0.1ml 酶液。用加热煮沸 5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入 2.0ml 20% 三氯乙酸终止反应，然后，过滤 ( 或 5000g 离心 l0min)，适当稀释，470m 波长下测定吸光度。
3. 结果计算
以每分钟内 A470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位 (u)。
过氧化物酶活性 =(△A470 · VT) ·（ 0.01W·Vs ·t）-1 式中：△A470 一 反应时间内吸光度的变化 ；
w 一 马铃薯鲜重 (g)； t 一 反应时间 (min)；
Vt 一 提取酶液总体积 (ml)； Vs 一 测定时取用酶液体积 (ml) 。
（完整版）逆境生理指标的测定
