实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定一、 目的
了解米氏常数的意义,测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、 实验原理
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2,未分解的H2O2用KMNO4在酸性
环境中滴定,根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶,以1/ν~1/[S]作图求Km
三、 实验器材
1. 锥形瓶100~150ml(×6)。
2. 吸管1.0ml(×2)、0.5ml(×2)、2.0ml(×2)、5ml(×2)、10.0ml(×1)。 3. 温度计(0~100℃)。 4. 微量滴定管5ml(×1)。 5. 容量瓶1000ml(×1)。 四、 实验试剂
1、0.02mol/L磷酸缓冲液(Ph7.0)
取磷酸二氢钾 0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml,用水稀释至100ml,即得。
2、酶液:称取马铃薯5g,加上述缓冲液10ml,匀浆,过滤。
3、0.02mol/L KMnO4 :称取KMnO4(AR)3.2g,加蒸馏水1000ml,煮沸15min,2d后过滤,棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4 :准确称取恒重草酸钠0.2g,加250ml冷沸水及10ml
浓硫酸,搅拌溶解,用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色,水浴,加热至65℃,继续滴定至溶液微红色并30s不褪,算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2:取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中,加蒸馏水至刻
度(约0.2mol/L),用标准KMnO4(0.004mol/L)标定其准确浓度,稀释成0.05mol/L(标定前稀释4倍,取2.0ml,加25% H2SO42.0ml,用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色)。 6、25% H2SO4
五、操作
取锥形瓶6只,按下表顺序加入试剂:
表一 过氧化氢酶米氏常数的测定
管号 试剂 0.05mol/L H2O2/ml 蒸馏水/ml 酶液/ml 0 0 9.5 0.5 1 1.00 8.50 0.5 2 1.25 8.25 0.5 3 1.67 7.83 0.5 4 2.5 7.0 0.5 5 5.00 4.50 0.5 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水,加酶液后立即混合,依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应,充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色,记录消耗的KMnO4体积。 六、计算
分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10
式中[S]:底物物质的量浓度(mol/L); c1:H2O2物质的量浓度(mol/L);
V1:H2O2体积(ml);
10:反应的总体积(ml); υ:反应速度(m mol/min);
c2:KMnO4物质的量浓度(mol/L);
V2:KMnO4体积(ml); 以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二 酶促反应中初速度时间范围测定
一、实验目的
1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理; 2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。 二、实验原理
酸性磷酸酯酶(acid phosphatase, EC 3.1.3.2)广泛分布于动植物体中,尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯(4-nitrophenyl phosphate, NPP)作底物,水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中,对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈,而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性,可以定量的测定产物的生成量,从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下,每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定,首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下,采用每隔一定时间测定产物生成量,以酶反应时间为横坐标,产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知,在曲线起始的一段时间内为直线,其斜率代表初速度。随着反应时间的延长,曲线趋于平坦,斜率变小,反应速度下降。要真实反映出酶活力大小,就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材 1.试剂
(1)酸性磷酸酯酶原液(从绿豆芽中提取) (2)酸性磷酸酯酶液(通过原酶液稀释得到)
取原酶液,用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释,使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6~0.7之间。
酶工程实验3资料
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