分子生物学技术在昆虫系统学研究中的应用

由天下分享时间：2025/1/22 11:45:12 加入收藏我要投稿点赞

分子生物学技术在昆虫系统学研究中的应用

[摘要]分子牛物学技术应用于昆虫系统学研究，是50年代末新兴起来的，近年来发展相当迅

速。为了把握这个研究方向，并促进这个研究领域的发展，作者从研究方法、研究内容、研究对象等方面着手，近10年来分子生物学技术应用于昆虫系统学，并对其的研究进展进行了概括和总结。介绍了DNA序列测定、RFLP、分子杂交技术、RAPD、SSC及DSCP等几种主要方法及其应用情况，并从分类鉴定、系统发育分析、分子进化、遗传变异及进化研究等方而总结了已有的研究成果，日前已进行过分子系统发育研究的昆虫类样进行了列表总结。

[关键词]分子生物学技术；昆虫系统学.

本世纪70年代，由于限制性内切酶的发现,DNA重组技术的建立,DNA序列快速测定方法的发明，分子生物学及其技术以迅猛的速度发展。80年代，PCR技术的产生和发展，加速了分子生物学技术在生物学各研究领域的广泛应用，分子生物学技术应用于昆虫系统学研究中，始于本世纪80年代末，近些年来发展迅速，通过研究昆虫核酸分子的结构来探求各类群之间的亲缘和进化关系，从生命的本质上子找昆虫各类群之间的内在联系。作者从研究方法、研究内容及研究对象二方面对近10年来昆虫分子系统学的研究进展作简要的综述。 1研究方法

前用于昆虫分子系统学研究的卞要方法有核酸序列分析(DNA sequence analysis)、RFLP(限制性片段长度多态性分析，Restriction fragment length polymorphism)、分子杂交技术( Molecular hybridization) ,RAPD(随机扩增DNA多态性分析，Random amplified polymorphicDNAI) ,SSCP(单链构象多态性，Single strand conformational polymorphism)和DSCP（链构象多态性，Double strand conformational polymorphism)分析等方法。 1. 1 DNA序列分析

DNA序列分析是通过直接比较不同类群个体同源核酸的核茸酸排列顺序，构建分子系统发育树，并推断类群间的系统演化关系、最可靠的方法。但序列分析耗资较大，也很费时，所以不适宜于大群体的遗传进化研究。但随着生物技术的不断提高，药品、试剂盒及酶制剂越来越廉价，此方法将会得到广泛应用。此方法与RFLP及DSCP等其它方法相结合，可快速而经济地测

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定大量个体，此乃今后发展的方向。日前已对许多昆虫核基因组中的核糖体DNA(r DNA)及线粒体DNA(mtDNA)进行了序列测定，并进行了相应的系统发育分析。 1. 2 RFLP分析

RFLP是应用限制性内切酶切割不同类群个体的基因组DNA或某一基因，产生不同长度的限制性片段，根据酶切图，计算类群之间的遗传距离，构建系统树。此方法的优点是快速〃经济、简便，而A结果也比较可靠，因此特别适合大群体的遗传、进化研究。通常用于RFLP研究的是线粒体基因组DNA( mt DNA，因为昆虫的mt DNA较小，基因结构较清楚，用限制性内切酶切割后可直接进行分析。而昆虫核基因组DNA复杂，酶切后片段很多，很难确定其同源性，击进行分子杂交后才能分析，所以用mt DNA进行RFLP分析的研究较多。目前，也有采用RFLP与PCB相结合的方法，先选用特定引物将某一片段进行PCB扩增和克隆，然后再进行RFLP分析。但RFLP分析远不如核酸序列分析提供的信息量多，而且结果也不如后者可靠，所以，RFLP通常只用于种类鉴定或种内种群间的遗传进化研究，很少用于种上阶元的系统发育分析。 1. 3分子杂交技术

分子杂交的基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链，在一定的条件下可按碱基互补原则退火形成双链，杂交过程是高度特异性的。用于杂交的双方是待测核酸序列和探针。用带有标记的已知核茸酸片段作为探针，来检测目的基因或DNA片段的存在及变异情况。此方法用于昆虫近缘种和复合种的鉴定效果较好。但此方法要求对研究类群的遗传背景有一定的了解，而目探针的制备也较麻烦，因此，探针杂交技术应用并不广泛，通常只用于小型医学昆虫的种类鉴定。 1. 4 RAPD

RAPD是在PCB基础上，采用单个人工合成的随机引物(一般为10 bp)对基因组DNA进行扩增，所用引物G+ C含量在50%一70%之间。此方法的优点是:a.快速、简便，整个实验能在24h以内完成，而目只击具备分子生物学实验的基本条件就可进行，也尤击昂贵的试剂及仪器设备;b.反应灵敏;c.对遗传背景不清楚的材料也能进行。此方法的缺点是:反应过于灵敏，极易受外源DNA的污染，可贡复性低。在昆虫中，最早由Black等将此方法应用于4种蚜虫的鉴定比较，根据电泳图r,能明确区别4个种。同时，还检测了种内不同生物型、同一生物型内不同个体，以及同一种群内不同个体之间扩增产物的多态性。此外，还用RAPI)技术检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂。Kambhampti等采用RAPI技术对蚊虫的种和种群进行了鉴定和区分，并对

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RAPI的实验技术、统计分析及应用等进行了探讨。其后，RAPI在按蚊、寄生蜂、舞毒蛾、粉虱、蚜虫、蝗虫、果蝇等昆虫中均有应用。在这些研究中，RAPI大多用于近缘种、复合种和种内生物型的识别和鉴定，以及地理种群的遗传进化研究。RAPI在系统发育分析上的应用，还有一定的争论，例如，Vanlerberghe Mesutti采用RAPI的方法成功地对膜翅b纹翅卵蜂科的种类进行了系统发育分析，但Zande将RAPD应用于果蝇种间的系统发育分析时，却得出相反的结论，认为RAPD尤法得到可靠的遗传距离先要计算出分类单元间的遗传距离，遗传距离的算法以Jukes的单参数法和Kimura的双参数法较为常用。在获取距离距阵后，按一定的规则，根据各距离值间的内在关系构建系统树。距离法构建树的方法有多种，影响最大的是Saitou的邻接法Sneath的不加权对群分析法(Unweighted pair group with mathematicalaverage, UPGMA)。距离法适合于分析各种方法获得的分子数据如序列测定,RFLP ,RAPD等。似然法首先击要确定一个序列进化的模型，如Kimura的双参数模型等，然后淤找在该进化模型下最有可能产生所研究的DNA序列数据的系统树，由于这类方法计算特别复杂费时，因此其应用不如前两类方法普遍。在似然法中，影响最大的是最大似然法(Maximum likelihood method)。以上3类方法都是在一定的前提条件下进行的，因而有一定的运用范围，由于作者对许多条件所知甚微，因而很难判断在某一具体情况下哪种方法最佳。最好是同时合用多类方法构建系统树，若多种方法所获系统树的拓扑结构一致，将大大提高结果的可靠性目前用于分子系统发育分析的主要常用软件有:MacClade，Phylip， Mega。 2研究内容

2. 1种群遗传变异及进化的研究

检测和描述种内各种群的遗传结构及变异状况，探讨物种的形成与分化的内在机理。内容包括自然地理种群及社会性昆虫的社会种群研究。通常采用的方法有RAPD ,RFLP ,SSCP和DSCP，而DNA序列测定用于种群研究较少。此方面的研究有:Chapco等采用RAPI对蝗虫种群的研究; Kambhampti等、Ballinger Grabtree等采用RAPI检测按蚊的亚种及种群变异;陈燕茹等采用RAPI分析果蝇的地理种群变异;土文等、贾振宇等用mt DNA的RFLP方法分析果蝇的自然种群;Martinez等研究mt DNA在蚜虫地理种群内的变异; McLain等分析按蚊地理种群中rDNA NTS片段的变异; Pnterka等采用RAPD PCB分析蚜虫种群的遗传变异; Atkinson等采用mt DNA的DSCP方法分析社会性昆虫种群的遗传变异。 2. 2种及种下阶元的分类鉴定

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主要是对近缘种和复合种、种下亚种与生物型的识别和鉴定。此研究最为可靠的方法是分子杂交技术，在医学昆虫的研究中应用较多，如用DNA探针鉴定按蚊复合种。采用RAPD、 RFLP及SSCP ,DSCP也能进行种类鉴定，Black等采用RAPI技术成功地检测了蚜虫的种及种内不同的生物型以及蚜虫体内的寄生蜂; VanlerbergheMesutti用mt DNA的RFLP、 RAPI分子标记有效地鉴定膜翅b寄生蜂种类; Boge等采用PCB SSCP对步甲种类进行了鉴定。 2. 3系统发育分析

系统发育分析是系统学研究的热点，通过分子系统发育研究，对传统分类有疑问的类群或形态分类不能解决的类群的系统发育进行分析和探讨，也可对传统的分类系统进行验证。分子系统发育研究采用的数据通常是DNA序列，RFLP数据也可用于低级阶元的系统发育分析。目前已有许多类群进行了分子系统发育分析，从种级至目级阶元都有研究。分子系统学研究结果与传统的分类系统及形态支序分析的结果有的相一致，但有的却很矛盾，如Camp-bell等Dohlen等根据18S rDNA片段序列构建的分子系统树证明:同翅目并非为一个单系群，而是一个平行进化的类群。Chalwatzis等、Whiting等根据18S和28S rDNA的序列分析，证明捻翅目与双翅目亲缘关系较近，而与鞘翅目关系却较远，而传统分类学一直认为捻翅目与鞘翅目关系较近，有的学者并把它作为鞘翅目中的一个总科。这样，分子数据与形态数据结果不统一，在现有研究水平下很难说哪种方法得出的结论更可靠，目前较为折中的办法是把分子性状和形态性状综合起来分析2. 4分子进化。

分子进化的研究目的是构建基因或DNA分子的进化树，并探索生物大分子的进化机制和特征。这类研究卞要集中在亲缘关系比较明确的类群或高级阶元类群之间进行，研究对象以rDNA及mt DNA为主要研究对象。 3 研究结论 3. 1 rDNA

r DNA是编码核糖体RNA的基因，是一类中度重复的DNA序列，以串联多拷贝形存在于染色体DNA中，每个重复单位由非转录间隔区(norr transcribed spacer, NTS)、转录间隔区( internal transcribed spacer, ITS)。 3种RNA(18S ,5. 8S ,28S rRNA)基因编码区组成rDNA 3个区域的DNA进化速率各有不同，编码区总的来说，进化速率很慢，非常保守，适合于构建生命系统树的基部分支，但编码区内，又可分为高度保守区、保守区、可变区和高变区，这些不同的区域，

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适合于不同阶元类群的系统发育研究;转录间隔区为中度保守，适合于推断5-10年左右的进化事件;非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间关系的研究。由于rDNA是生物界普遍存在的遗传结构，具有多拷贝性及上述种种优点，因而在个体及群体内有较好的均一性，少量样品能有效代表其来源群体的rDNA的变异情况。因此，rDNA已成为生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记。

自Hillis最先将rDNA用于系统发育分析之后，rDNA在不少昆虫类群的系统进化和分类研究中已得到广泛的应用。其中，编码18S和28S rRNA的基因片段用于系统发育研究较多，常用于科级以上水平的系统发育分析,高可变区序列也可用于属级或种级水平的系统发育关系研究。编码5. 8S rRNA的基因片段由于太短，一般很少单独使用。Wesson等首先开始蚊子的ITS片段比较研究，其后Campbell等将ITS片段用于膜翅b金小蜂科复合种的系统发育分析, Porter等及Paskewitz等分别将ITS片段用于双翅目按蚊科复合种的系统发育分析中, Kuperus等用ITS进行蝗科蚌蜕亚科的系统发育关系分析。 3. 2 mt DNA

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线粒体DNA( mitochondrial DNA mtDNA)为双链闭环分子，昆虫的线粒体DNA大小为15. 4-16. 3kb左右，其中含有编码2个核糖体RNA(12S rRNA人16S rRNA) ,22个tRNA ,1个细胞色素b，3个细胞色素氧化,6个NADH降解和2个ATP酶的基因。由于线粒体DNA在分子进化中有许多独特的优越性:mt DNA的提取类似于质粒，相对于核基因的分离较为容易，基因组小，具高拷贝数目;基因组中不含间隔区和内含子，重复序列，在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变;遗传过程中遵守严格的母系遗传方式，从而避免了双亲遗传方式引起的随机性;而目，虽然线粒体基因组的基因排列顺序高度保守，结构稳定，但mtDNA序列的取代速率却比核DNA高5-10倍，因此，由于以上结构和进化上的特点，mtDNA已成为研究进化的贡要材料。最先用mt DNA的基因对昆虫纲10个进行了系统发育分析，其后不少学者采用mtDNA对昆虫不同阶元类群进行了系统发育分析，研究范围从种内种群之间至高级阶元之间的系统发育分析均有。通常用于系统发育分析的基因是16S rRNA ，其它基因也有应用，尤其是控制区(A- T丰富区)已开始受到重视。 3. 3其它基因

利用rDNA或mtDNA基因进行系统学研究，拥有技术条件优势，并有适用于分类学大范围

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