自噬对巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的影响

自噬对巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的影响

吕允相，吴惠梅，方 磊，刘荣玉

【摘 要】摘要：目的探讨金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）对巨噬细胞自噬的影响，并研究其在巨噬细胞吞噬病原微生物中的作用。方法以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，以磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）为干预药物，空白处理作为对照组，金葡菌感染作为实验组，3-MA干预作为抑制组。金葡菌感染细胞后，Western blot检测自噬蛋白Beclin1、LC3以及吞噬相关蛋白Rac1的表达，激光共聚焦显微镜观察自噬、吞噬现象。结果金葡菌感染RAW264.7 1 h后，实验组LC3Ⅱ和PI3K蛋白表达最强（P＜0.05），抑制组Beclin1和LC3Ⅱ表达显著降低（P＜0.05），自噬颗粒聚集显著减少（P＜0.05），Rac1表达显著降低（P＜0.05），同时，RAW264.7吞噬金葡菌数目显著减少（P＜0.05）。结论金葡菌诱导的自噬增强了巨噬细胞吞噬能力，自噬抑制剂3-MA抑制PI3K活性的同时，减弱了巨噬细胞自噬吞噬金葡菌的能力。 【期刊名称】安徽医科大学学报 【年(卷),期】2014(000)006 【总页数】5

【关键词】吞噬；自噬；巨噬细胞；磷脂酰肌醇3激酶；金黄色葡萄球菌 外来微生物进入身体无菌部位时，巨噬细胞通过趋化作用黏附、内化这些病原体，最终被清除，并产生细胞因子，诱导机体炎症反应，从而保护机体组织和器官［1］。自噬是哺乳动物细胞降解自身老化细胞器和蛋白集聚体必不可少的稳态过程，营养缺乏和免疫信号激活都能够诱导自噬从而清除细胞自身成分。

研究［2］表明自噬具有桥接先天免疫和后天免疫的功能，自噬通路能够平衡免疫和炎症，从而对抗感染、自身免疫病和炎症性疾病。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）家族是一类磷酸化酶，目前已知的有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型都在自噬中有重要作用，Ⅰ型PI3K通过激活下游蛋白参与自噬，而Ⅲ型PI3K通过与Beclin1蛋白结合参与自噬过程［3］。酵母多糖可以通过Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）招募Beclin1和激活PI3K诱导RAW264.7发生自噬［4］。金黄色葡萄球菌（简称金葡萄）是一种革兰阳性球菌，临床上分为耐甲氧西林金葡菌与甲氧西林敏感性金葡菌，其致病性主要是其细胞壁成分及产生外毒素和酶，然而金葡菌刺激巨噬细胞后能否诱导其自噬，以及自噬过程的激活能否增强巨噬细胞吞噬病原微生物尚不清楚。该实验以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，研究金葡菌诱导的巨噬细胞自噬对其吞噬能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及菌株 小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7购于上海细胞库；金黄色葡萄球菌NCTC8325由中国科学技术大学生命科学学院孙宝林教授馈赠。 1.1.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基、Lipofectamine 2000、胎牛血清、青霉素和链霉素购于美国Invitrogen公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒购于中国Solarbio公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购于美国Sigma公司；LC3多克隆抗体购于美国Novus Biologicals公司；PI3K、Beclin1和Rac1单克隆抗体购于美国Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的GAPDH和β-actin一抗购于中国康城公司；HRP标记的羊抗兔和兔抗鼠二

抗购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；ECL化学发光检测试剂盒、细胞培养箱购于美国Thermo公司；细胞培养板购于美国Corning公司；LSM510激光共聚焦显微镜购于德国蔡司公司；ELX800酶标仪购于美国Bio-Tek instruments公司；蛋白电泳转移系统购于美国Bio-Rad公司。 1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞用含10%胎牛血清、100 U／L青霉素和100 μg／ml链霉素的DMEM培养于37℃、5%CO2培养箱内，根据细胞数目形态2～3 d传代1次，保持细胞处于对数生长期。

1.2.2 细菌培养 金葡菌在0.1%氯霉素的LB培养基（胰蛋白胨10 g／L；酵母提取物5 g／L；氯化钠10 g／L）中培养20 h后，测定其650 nm处吸光度（optical density，OD650）（OD650＝5.0，约5×109／ml），16%甘油冻存，－80℃保存。

1.2.3 金葡菌感染细胞 将对数生长期的RAW264.7按1×106／ml的密度分别接种6孔板，培养过夜。PBS清洗金葡菌3次，用不含抗生素的DMEM培养基重悬并稀释，根据预实验结果，按感染复数（multiplicity of infection，MOI）为100∶1（细菌∶细胞）加入培养板中感染细胞。将实验分为3组：空白处理作为对照组，金葡菌感染作为实验组，3-MA干预作为抑制组。 1.2.4 MTT检测3-MA作用下RAW264.7活力PBS冲洗细胞后，加入0.25%胰酶消化，待细胞形态变圆时弃去胰酶，用培养基轻轻吹落细胞，计数将细胞密度控制在5×104／ml，种于96孔板中36孔，每孔100 μl，96孔板四周孔加入PBS，每孔100 μl，放入培养箱内培养过夜，待细胞完全贴壁，密度约90%后，分别加入0、1.25、2.5、5和10 mmol／L 3-MA处理2 h后，弃去