DNA芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因
潘建华 彭雪峰 邓为之 石国民 向延根
【摘 要】【摘要】 目的 应用 DNA芯片杂交技术快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)的耐药性,并评价其临床应用价值。方法 采用 DNA芯片技术,将固定于硝酸纤维素膜上的四种药物常见耐药基因的特异性探针,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应产物进行杂交,共对 97株临床分离株进行检测,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较。结果 INH、RIF、SM和 EMB的耐药基因检出的灵敏度分别为 89.6%、98.6%、81.8%和 88.2%,特异度分别为 93.3%、100%、100%和 100%。结论 简便快速敏感的 DNA芯片杂交方法适用于临床批量结核分枝杆菌耐药性的初筛。 【期刊名称】临床肺科杂志 【年(卷),期】2010(015)006 【总页数】4
【关键词】【关键词】 结核;分枝杆菌;核酸杂交;药物耐受性;突变
近几年耐多药/广泛耐药结核病的出现和蔓延严重阻碍了我国结核病防治工作的进程,已成为严重的公共卫生和社会问题。2007～2008年全国结核病耐药基线调查显示我国肺结核病人中耐多药率为 8.32%,广泛耐药率为 0.68%,据此计算,我国每年新发耐多药肺结核患者 12万例[1]。2008年 WHO《世界耐抗结核病药物报告》中提到,耐多药结核病发病率创历史最高记录,中国仅次于俄罗斯。可见建立准确而快速的药物敏感性检测方法具有极其重要的意义。本研究旨在应用 DNA芯片技术快速检测临床分离株中的耐药结核杆菌基因型,为该技术在结
核耐药性领域的研究和应用奠定基础。
材料与方法
一、材料
97株试验菌株来自我院 2008年 2月 ～12月门诊和住院患者临床分离菌株,包括 4株对四种药物全部敏感菌株和 93株单一或耐多药菌株。根据《结核病诊断细菌学检验规程》[2]进行菌种鉴定和传统药敏试验,所有试验菌株均被鉴定为结核分枝杆菌。绝对浓度法药敏结果判定标准参考2001年中华医学会结核病学分会颁布的肺结核诊断和治疗指南[3]。H 37RV敏感株(ATCC 27294)来自北京结核病胸部肿瘤研究所参比室。 二、方法
1 DNA制备 将试验菌株接种于改良 L-J培养基斜面上,37℃培养2～3周,刮取菌落悬浮于 1×TE液。用细菌基因组 DNA提取试剂盒(北京天根公司 H 6529)提取 DNA(操作步骤详见说明书),-20℃保存备用。
2 目的基因扩增 设计可以分别特异扩增人型、牛型及非洲型分枝杆菌的 ropB、katG、inhA、rpsL和 embB基因的引物(见表 1),下游引物 5′端含有生物素标记。
PCR反应液分成两管,各 25μl,第一管扩增 ropB、katG和inhA基因,第二管扩增rpsL和 embB基因。反应体系包括模板 DNA 20 ng、2.5mM dNTP 2μl,25mM MgCl2 1.5μl,25 μM上下游引物各 0.5μl,2.5U DNA Taq酶,2.5μl 10×PCR缓冲液。在ABI-7300上扩增带有生物素标记的目的基因片段,扩增参数:50℃ 2min;95℃ 10 min;95℃ 45 sec、68℃ 1 min,30循环;95℃ 30 sec、54℃ 30 sec、68℃ 1 min,30循环;68℃10m in。扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶
电泳后紫外灯下检测。
3 探针设计合成及标记 根据 ropB、katG、inhA三个基因的探针序列见参考文献[4],rpsL和 embB基因的探针(见表2)。所有探针通过Miniblotter MN45标记于杂交膜上。
4 芯片反应与结果判读 取出芯片,用铅笔在其空白区编号,放入 15ml塑料离心管中,加入 4～6ml杂交缓冲液(1×SSC,0.1%SDS)和相应的两管 PCR产物,沸水浴 10min,放入预热的杂交箱中 59℃杂交 90m in;取出膜条,转移至装有 40ml预热洗液(0.5×SSC、0.1%SDS)的离心管中,59℃轻摇洗涤 15min;移出膜条,配制 1∶2000的 POD溶液,室温轻摇洗膜 30min,弃去 POD液;用杂交缓冲液室温轻摇洗涤 5 min,共洗两次;,将洗好的膜条浸泡于显色液(19ml 0.1M柠檬酸钠、1ml 2mg/m l TMB、10μl 3%H2O2),避光显色 10～20min,观察结果。
结 果
一、绝对浓度法药敏试验结果
97株临床分离株中,4株敏感株对四种药物全部敏感,72株对 RFP耐药,67株对 INH耐药,44株对 SM耐药,34株对EB耐药;耐多药菌株 59株,多耐药菌株 38株,21株对四种药全部耐药。 二、PCR扩增的特异性
每批次扩增均设立阴性对照和阳性对照(H 37RV),扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察条带。阴性对照无扩增条带,阳性对照有 5条带,分别是 190bp、210bp、240bp、290bp和 460bp。 三、DNA芯片试验结果
H 37RV以及 4株敏感菌株未检出任何突变基因。
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