内源蛋白酶在低温
1111 保鲜草鱼质构劣化中的作用与控制研究
淡水鱼肉质细嫩，营养丰富，作为优质责白來源深受消费者的喜爱。但是鱼类 在宰杀后因微生物、内源酚和化学变化易品质劣化,因而亟需有效的保鲜技术。
冰藏和微冻保鲜是应用广泛的水产品保鲜技术,能够有效抑制微生物活动和 化学变化「目前无论是淡水鱼还是海水鱼在低温保鲜过程中仍会出现不同程度的 质构劣化,而劣化机理还不完全清楚。
尽管国内外研究者对海水鱼质构劣化中内源蛋白酹的作用以及淡水鱼内源 贵白酶的酶学性质己有较充分认识，但是内源蛋白酶在低温保鲜淡水鱼质构劣化 中的作用仍不明确,而淡水鱼低温贮诫过程中质构劣化问题也尚未得到有效解决。
本文以大宗淡水鱼草鱼为研究对象，通过对草鱼片低温保鲜过程中内源蛋白酶活 性变化和对鱼肉蛋白的降解作用及与鱼肉质构变化间的关系研究,明确引起低温 保鲜淡水鱼质构劣化的关键责白嗨，揭示内源蛋白酶对鱼肉主要结构蛋白组分的 降解作用与过程,并建立基于内源蛋白酶抑制的淡水鱼保鲜技术。
本研究对明确低温保鲜淡水鱼品质劣化机制具有重要的学术意义，同时为高 品质保鲜淡水鱼肉制品的开发提供理论依据。首先研究了草鱼低温保鲜过程中的 蛋白质变化及与鱼肉质构品质的关系。
通过测定剪切力和蛋白降解产物、$白组成.肌原纤维结构调控因子.EDC 交联结合SDS-PAGE以及相关性分析,研丸草鱼片冰藏和微冻贮藏期间的蛋白变 化规律及与鱼片质构特性变化间的关系。结果表明:冰藏和微冻保鲜鱼片在贮藏
6天内剪切力显苦下降45%-51%;鱼肉贮藏过程中肌原纤维碎片化加剧，不溶性蛋
白和盐溶性蛋口减少，水溶性蛋白、氨基态氮、TCA-溶解肽和非蛋白氮逐渐增加; 肌原纤维蛋白中oB-crystallin和HSP27的减少以及肌球蛋白轻链的去磷酸化 导致肌动球蛋白解离，肌原纤维蛋白中UNC45和HSP90的减少导致肌原纤维蛋白 粗丝解离,释放出肌球贵白重链(MHC)和轻链(MLC)并逐渐被降解;造成鱼肉质构 劣化的主要蛋白变化是MHC和MLC的解离和降解，而肌动球蛋白的解离也对鱼肉 贮藏初期(1天内)的质构劣化有一定贡献。
研究了内源蛋白酶在冰藏保鲜草鱼质构劣化中的作用。苒先利用叠氮钠和碘 乙酸分别建立内源蛋白悔主导和微生物主导的鱼肉模拟体系，通过测定微生物、 内源蛋白酶活性、蛋白降解以及剪切力变化,从整体水平比较内源蛋白酶和微生 物对鱼肉质构劣化的作用，并进一步通过测定鱼肉冰藏期间亚细胞结构中内源蛋 白酶及其特异性抑制剂的活性、分布变化及与剪切力的相关性分析引起鱼肉质构 劣化的主导内源蛋白酶。
结果表明：内源蛋白酶是引起冰藏保鲜草鱼片质构劣化的主导因素,其中组 织蛋白酶B,L和钙激活蛋白酶是引起鱼肉质构劣化的关键内源蛋白酶；由于从溶 酶体中的释放和抑制剂cystatini'fi性的下降，组织蛋白酶B和L在肌浆和肌原纤 维蛋白中的活性分别在冰藏前6天上升了 1.4倍.1.9倍和6.0倍、2. 4倍，略下 降后趋于稳定，因而其作用贯穿丁?整个质构劣化过程;钙激活蛋口酶因其抑制剂
calpastatin活性的上升而活力受限,酶活在12h内上升了 1. 0倍，且在2天后逐
渐失活，因而仅对鱼肉贮藏初期的剪切力下降起作用。从分子水平研究了内源蛋 白酶对草鱼肌原纤维蛋白的降解模式和解离作用。
利用重组蛋白酸和肌原纤维蛋白分别建立单酶、酶组合和顺序作用的模拟体 系，通过EDC交联结合SDS-PAGE和HSP含最测定研究蛋白酶对肌原纤维蛋白降解 和解离的协同作用模式。结果表明：在肌原纤维蛋口解离和降解过程中，组织蛋白 酶B和钙激活蛋白晦.组织蛋白酶L和钙激活蛋白酶之间存在以先后顺序为基础
的协冋作用;组织蛋白酚B通过降低肌原纤维蛋白中UNC45和HSP90的含量，促进 肌原纤维蛋白粗丝中MHC和MLC的解离，推进鈣激活蛋白酶的后续作用;组织蛋白 酶L通过降低肌原纤维蛋白中HSP27和a B-crystallin的含量，促进肌原纤维蛋
白细丝中肌动蛋白的解离，推进钙激活蛋白酶的后续作用;组织蛋白酶B和组织 蛋白酚L降解肌球蛋白重链产生分子量约为140 kDa和150 kDa的片段，钙激活
蛋白酶通过降解这两种片段促进组织?白酶B和L的持续作用；模拟体系中肌原 纤维蛋白降解模式与冰藏保鲜鱼肉基本一致,证实了内源蛋白酶对肌原纤维蛋白 的降解和解离是引起鱼肉质构劣化的主要因素。
建立了基于内源蛋白醜抑制的淡水鱼保鲜技术。通过测定蛋白幽活性结合
SDS-PAGE初步确定大蒜素和葱属植物提取物对鱼肉粗酶液中内源蛋白酶降解肌
原纤维蛋白的抑制作用。
釆用注射法和浸泡法将大蒜素和葱屈杭物提取物添加到鱼肉中，通过分析鱼 肉在冰藏保鲜过程中内源蛋白酸活性、质构特性以及蛋白变化，进一步确定适用 于草鱼冰藏保鲜的有效大蒜素浓度和葱屈杭物提取物种类。结果表明：大蒜素抑 制冰藏保鲜鱼片质构劣化的有效浓度为10-100 mmol/L,在此条件下，鱼肉冰藏3
天后组织蛋白酶氏L和钙激活蛋白酶的活性分別下降至11%, 40%和48%以下，有效 抑制了肌原纤维蛋口的降解和解离，在21夭后鱼片剪切力比对照组高39%-51%;
大葱利大蒜中的硫代亚磺酸酯含量均大于0. 9 nunol/g,这两种提取物能够将鱼肉 组织蛋白酶B,L和钙激活蛋白酶的活性降低到50钦43%和36%以下,从而抑制冰藏 草鱼肉的肌原纤维蛋白降解和质构劣化，冰藏21天后鱼片剪切力较对照组分别 提高36%和22%。
本文明确了引起冰藏保鲜草鱼片质构劣化的主要蛋白变化是肌球蛋白的解 离及肌球蛋白重链和轻链的降解，证实了组织蛋白酶B,L和钙激活蛋白酶是造成 鱼肉质构劣化的关键内源蛋白海，从分子水平阐明了组织蛋白酶B,L和钙激活蛋 白酶对肌原纤维蛋白降解和解离的协同作用模式，初步揭示了冰藏保鲜草鱼片质 构劣化的机制，建立了基于内源责白酚抑制的淡水鱼保鲜技术。
内源蛋白酶在低温保鲜草鱼质构劣化中的作用与控制研究
