③ 涂抹法：用羊毛脂、琼脂或甘油将秋水仙素按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理时间 24 ～ 48h ；处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水淋洗。
④ 注射法：采用微量注射器将一定浓度的秋水仙素溶液注入植株的顶芽或侧芽中。
⑤ 离体法：在组织培养过程中，将适量的秋水仙素加入培养基，经短期培养后，再转入无秋水仙素的培养基中继续培养，便可获得多倍体。此法诱变率高，易得到同质纯合的多倍体。
2 ．多倍体的鉴定
一般采取先间接鉴定，再直接鉴定的方法。 1 ）间接鉴定法 常采用的鉴定方法有 3 种。
①外部形态鉴定：观察四倍体与二倍体幼苗，从叶片厚度、颜色深浅、植株生长强弱等方面加以区别。一般多倍体表现为茎粗壮，叶厚而皱，叶色变深，生长速度减慢，花器变大等。
②气孔鉴定：借助刀片和镊子撕取一小块叶片下表皮（应呈透明薄膜状），置于载玻片上，滴一滴蒸馏水或 I 2 -KI 溶液，加上盖玻片，在显微镜下观察气孔的密度，并用目镜测微尺测量气孔保卫细胞的长 度 × 宽度 ；统计气孔保卫细胞中叶绿体的数目。测定 50 个气孔的大小及其保卫细胞中叶绿体的数目，计算平均值。多倍体的气孔一般比二倍体长，单位面积气孔数比二倍体少，保卫细胞内叶绿体数目比二倍体多。
测量气孔长度的方法：先求目镜测微尺每小格的长度换算值。在显微镜下看准目镜测微尺与镜台测微尺前后两个完全重叠的刻度，数出双方两个重叠刻度间所包括的小格数目，依下式将目镜测微尺每小格换算为实际长度微米（ μ ）。
目镜测微尺每小格长度（ μ ）＝镜台测微尺小格数×每小格的长度（ μ ） / 目镜测微尺小格数。
用目镜测微尺量出气孔长、宽的格数，乘以换算值即得实际长度（ μ ）。当变换显微镜的目镜、物镜的放大倍数时，须重新调整换算值；不同的显微镜，即使用同样的放大倍数观察，也必须分别测算其换算值，不能彼此代用。
气孔的密度用目镜测微网测量，计算单位面积气孔的数目。
③花粉粒鉴定：将四倍体与二倍体的新鲜花粉撒于载玻片上，于显微镜下观察花粉的形态和大小；测定 100 个花粉粒的直径，计算其平均值。多倍体产生的花粉一般比二倍体大。
通过以上间接方法，初步鉴定出多倍体的可能植株，进一步进行直接鉴定。
2) 直接鉴定法 直接用诱变植株的根尖细胞或花粉母细胞制片染色，在显微镜下检测染色体的数目是否真正加倍。 六、实验结果分析
１．统计不同药液浓度、不同处理方法及不同处理时间处理后多倍体植株的诱导率。 供试材料 药液浓度 处理方法 处理时间 处理试材数 变异株数 诱变率 备注 2．观察变异植株（四倍体）与对照植株（二倍体）的形态特征，将观测结果填入下表：
供试材料 二倍体（2X） 四倍体（4X） 七、作业及思考题 １．说明四倍体与二倍体悬铃木叶片形态及气孔的区别？解释造成这种不同的原因？
２．你认为利用秋水仙素诱导多倍体的技术要点有哪些？
染色体数气孔密叶片形态 目 度 气孔(长保卫细胞花粉粒直备注 ×宽) 叶绿体数 径
实验六、植物培养基的配制与灭菌
一、实验目的
熟悉植物培养基的基本成分及其作用，掌握培养基的配制、分装方法及操作要求，掌握培养基与接种用品的灭菌原理及高压蒸汽灭菌锅的使用方法。 二、实验原理
培养基主要为离体培养植物材料的生长提供营养物质和生长调剂物质，通常分为基本培养基和完全培养基两个水平。前者包括大量元素（无机营养元素）、微量元素、有机附加物（维生素、氨基酸等）、糖和水，固体培养基还需加入凝固剂如琼脂；完全培养基是在基本培养基的基础上，根据不同的试验材料和目的，添加一定浓度的生长调节剂如 BA 、 NAA 等以及成分复杂的有机附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培养基还应具有适宜的 pH 值。不同种植物的离体培养，甚至同种植物不同器官或组织的培养对培养基的要求可能有些不同。园林植物离体培养常用的基本培养基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加入琼脂制成的培养基在 98 ～ 100 ℃下融化，于 45 ℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性会降低。
植物培养基含有丰富而全面的营养物质，能供养很多细菌、真菌等微生物的生长。因此，任何一种培养基一经制成便需及时彻底灭菌，以备培养之用；接种时使用的所有用品如滤纸、水等也要进行灭菌。一般采用高压蒸汽灭菌，于高压灭菌锅内进行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 ℃的条件下消毒 20 ～ 25min 。 三、主要仪器及试材
1．仪器用具
电子天平、称量纸、牛角匙、精密 pH 试纸、量筒、烧杯、胶头滴管、移液管、玻璃棒、培养皿或培养瓶、封口膜、电炉或微波炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅等。
2．药品试剂
大量元素（NH 4 NO 3 、KNO 3 、MgSO 4 ·7H 2 O、KH 2 PO 4、CaCl 2 ·2H 2
O ）、微量元素（KI 、H3 BO 3、MnSO 4 ·4H 2 O 、ZnSO 4 ·7H 2 O 、Na 2 MoO 4 2H 2 O、CuSO 4 5H 2O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有机成分（肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸）、FeSO 4 ·7H2 O、Na 2 EDTA·2H 2 O、琼脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、BA 、NAA 等。
四、实验方法与步骤
1．培养基母液的配制——以 MS 培养基为例
MS 培养基含有近 20 种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这些成分单独进行称量，可将培养基中的各类成分，分别按原用量的 20 倍或 200 倍配成浓缩液，即培养基母液。这样每次使用时，取其总量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培养液（基）。
1）大量元素母液（ 20 ×）：分别称取 33g NH 4 NO 3 、38g KNO 3 、7.4g MgSO 4 7H 2 O 和3.4g KH 2 PO4，装入500ml 烧杯中，加入适量蒸馏水将其充分溶解；另称取8.8g CaCl 2·2H2O，单独溶于 200ml 蒸馏水。然后将二者混合，定容至1 L ，充分混匀后于 4 ℃条件下贮存备用（下同）。
2）微量元素母液（ 200 ×）：分别称取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO 3 、166mg KI 、50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、5mg CuSO 4 ·5H 2 O、5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸馏水溶解后，定容至 1L 。
3）有机成分母液（ 200 ×）：分别称取 10g 肌醇、 50mg 烟酸、 50mg 盐酸吡哆醇、 50mg 盐酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。
4）铁盐母液（ 200 ×）：称取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2
EDTA·2H 2 O ，分别溶于 450ml 蒸馏水中，加热并不断搅拌使之完全溶解，然后将两种溶液混合，于 80 ℃水浴中充分熬合（ 30min ），最后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。
生长调节剂母液：称取 50mg 或 100mg 植物生长调节剂（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生长素类先用少量酒精溶解，细胞分裂素类先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸馏水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。
2．培养基的配制
以配制 1 L MS ＋ BA 1.0mg/L ＋ NAA 0.5mg/L 固体培养基为例，基本操作过程如下：
1）称取 30g 蔗糖和 7g 琼脂，装入 1 L 的容器（如烧杯）中，加入约 700ml 蒸馏水，置于带石棉网的电炉上或微波炉中加热，并用玻棒搅拌，至琼脂完全溶化。
2）用量筒或移液管分别取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有机成分母液和 5ml 铁盐母液，加入上述容器中。
3）分别用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培养基中，然后加蒸馏水将总体积定到 1000ml 。
4）以 0.5M NaOH 溶液将培养基的 pH 调至 5.8 ～ 6.0 ，混匀后分装于培养容器中，每瓶装入约 30ml 培养基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培养皿进行培养，配制好的培养基可先装入三角瓶，灭菌后（培养皿同时灭菌）于超净工作台上进行分装。
3．灭菌
将培养基、无菌水、滤纸、器皿等放入高压灭菌锅内，于 1.01kg/cm 2 压力、 121 ℃条件下灭菌 20min 。灭菌完毕后，将培养基取出（其他灭菌材料一并取出），水平放置于实验台上，待其冷却凝固后便可用于接种培养。
具体操作按灭菌锅的说明书进行，包括加水、装锅、盖盖、加热、排放冷空气、升压保温、降压排气、出锅冷却等步骤。
彻底灭菌后的培养基可于实验室内保存一段时间，但最好尽快使用。 五、实验注意事项
1．配制培养基母液的浓度应根据实际使用情况确定，最好能使母液在 1 ～ 2 个月内用完，其中有机成分要在 4 ℃冰箱内保存。大量元素母液的配制过程中， CaCl 2 必须单独溶解，然后再与其他成分的溶液混合，否则溶液中易出现沉淀；配制铁盐母液时，两种成分应单独溶解后再于 80 ℃左右充分熬合，避免发生结晶沉淀。
2．配制培养基的所用器皿和用具均应洗涤干净，培养基的 pH 值应调整准确，灭菌时间不宜过长，否则培养基可能会出现不凝固现象。
3．培养基配制后应及时进行灭菌，如因特殊情况不能及时灭菌，最好放入冰箱内暂存。
4．高压灭菌锅的使用应严格按照说明书进行操作，尤其注意检查锅内水位，防治干烧导致电热管损坏。 六、实验结果处理
１．5 ～ 6 人为一组，每组按要求配制一种培养基，分装灭菌。
２．记录培养基配制与灭菌的一般程序和注意事项。 七、思考题
１． MS 培养基的主要成分有哪些？在植物材料的离体培养中各起什么作用？ ２．如何保证灭菌后培养基能正常凝固？
３．简述高压蒸汽灭菌的工作原理及其操作要求。
园林植物遗传育种学实验指导书
