实验三、花粉生活力的鉴定
花期不遇给杂交工作造成困难，有的园林植物可通过调整花期来解决，有的则不得不进行花粉贮藏，或者从外地寄运花粉。为了避免杂交工作失误，在使用外地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉的生活力进行检测，以便提高杂交效率。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术 一、实验目的
掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。 二、实验材料
一串红、矮牵牛、油茶等植物的花粉。 三、仪器及药品
载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、毛笔、干燥器、小指形管、标签、记号笔、显微镜、天平、烧杯、培养皿、滴管、玻璃棒、量筒、电炉、石棉网、冰箱；
凡士林、无水氯化钙、蔗糖、琼脂、蒸馏水、硼酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碘、碘化钾、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。 四、实验原理
花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。
花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。
鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种：
1 ．直接测定法： 将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。
2 ．形态观察法： 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。
3 ．染色观察法： 1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法： TTC 染色是一种鉴定去氢酶活性的组织化学反应，凡具有生活力的花粉在其呼吸过程中都有氧化还原作用，当 TTC 渗入有活力的花粉时，其去氢酶在催化去氢过程中与 TTC 结合，使无色的 TTC 变成 TTF 而呈现红色。
4 ．培养基发芽法 在培养基上进行花粉的人工萌发，鉴定待测花粉萌发率的高低。此法若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异，所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。 五、实验步骤：
１．花粉的贮藏：
（１）将采集的花粉进行干燥（凉干或放入盛有无水氯化钙的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏结为度。
（２）将干燥的花粉装在指形管中（不要太多，一般以五分之一体积或更少为宜），瓶口塞以纱布，瓶外贴以标签，注明花粉种类、采收日期。
（３）将指形管放入无水氯化钙控制一定湿度的干燥器中，干燥器置于 0 ～ 2℃ 的冰箱内。
２．花粉生活力的测定：
（１）染色观察法 ——TTC 染色法
① 配制 TTC 染色液：称取 0.5g TTC 溶于 100ml 磷酸盐缓冲液（ 100ml 蒸馏水中溶解 0.832g Na2HPO 4 2H2O 和 0.273g KH 2 PO4， pH7.2 ）中，装入棕色瓶备用。
② 制片：取少量花粉于载玻片上，滴入 1 ～ 2 滴 0.5 ％ TTC 染色液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，于 35 ～ 40℃ 条件下净置 15 ～ 20min 。
③ 观察统计：在显微镜下观察三个不同的视野，凡被染成红色或玫瑰红的都是有生活力的花粉，黄色或不着色者为没有生活力的花粉。
（２）培养基发芽法 —— 固体培养基
① 配制培养基：称取 1g 琼脂， 5g 蔗糖，量取 94ml 蒸馏水，装入烧杯，加热使琼脂融化呈透明状（注意补充水分，以保持培养基的浓度），即配成 5% 浓度的培养基。同法配制 10% 、 15% 、 20% 浓度的培养基。
② 制片：用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片的凹槽内，放置片刻，使其凝固。
③ 播种花粉：将少量花粉均匀地撒播在培养基上，注意不可过多，否则难以观察。
④ 培养与观察：将制备好的片子放在垫有湿润滤纸的培养皿内，于 20 ～ 22℃ 的温箱中培养；待花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。观察时每片随机取三个视野，统计花粉总数及发芽数，计算平均萌发率（花粉总数不少于 100 粒）。 六、作业及思考题：
１、按下表统计实验结果
染色法测定结果记载表 平均花粉生活其中 其中 其中 花粉花粉花粉来源 生活总数 生活力总数 红色 黄色 生活总数 红色 黄色 红色 黄色 (％) 力 力 力 各视野中花粉粒数量及生活力 培养基法测定结果记载表 各视野中花粉粒数量及发芽率 培养平均生花粉1 2 3 基浓活力来源 发芽数/总发芽数/总发芽数/总度 发芽率 发芽率 发芽率 (％) 数 数 数 ２、绘一幅花粉粒发芽形态图。 ３、比较不同方法、不同浓度（培养基法）测得花粉生活力的高低，分析其原因。
实验四、园林植物开花习性的观察与授粉技术
一、实验目的
通过对园林植物花器结构及开花授粉习性的观察，了解不同园林植物种类的花器官结构特征与开花授粉特点，以及两者之间的关系；熟悉园林植物开花习性调查的主要观察项目和观察方法。 二、实验材料
悬铃木、月季、菊花、矮牵牛、石竹、金鱼草等园林植物。 三、实验用具
放大镜、解剖针、镊子、剪刀、直尺、记录板等。 四、实验原理
不同的园林植物因其自身的发育特点不同，往往具有不同的花器官结构特征和开花授粉习性。如有的园林植物为风媒花，而有的园林植物则靠蜜蜂、蝴蝶等传粉媒介进行授粉；有的植物花器官结构便于自花授粉，而有的则便于异花授粉。此项观察可作为识别品种、制定杂交计划的主要依据，也可为采留种子，选育不育系等提供理论依据。
五、实验内容
以悬铃木、月季、菊花、矮牵牛、石竹、金鱼草等园林植物为材料，详细观察其花器官的组成与结构特征，了解其开花授粉特点。
1 ．花器结构的观察
一般两性花植物的花朵由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官组成，多数植物的花朵基部还着生有花苞片，而单性花则缺少其中的雄蕊或雌蕊。通过观察比较，明确不同园林植物的花部构造及其形态特征，了解授粉习性与其之间的关系。
2 ．开花授粉习性的观察
1 ）花芽类型：植物花芽的类型基本上可以分为纯花芽和混合花芽两种类型。纯花其芽内只有花器官，芽 萌发后，只开花结果，不抽生枝条，多数花卉属于此类； 混合花芽在芽内除有花器官外，还存在枝叶或叶的原始体，开花的同时可抽生枝条，如悬铃木等。
2 ）开花时间及花期长短：不同的园林植物其开花时间差异较大，如梅花、玉兰、连翘等在早春开花，悬铃木、牡丹、芍药等春季开花，荷花夏天开，菊花秋天开，蜡梅则怒放于冬季，而月季、矮牵牛、四季桂等一年四季均能开花。此外，不同品种的始花期、盛花期、终花期及整个开花过程的长短也不相同。通过观察明确不同植物及品种的花期和开花规律对于人工杂交具有重要的指导意义。
3 ）花型：包括单瓣、重瓣，大花、小花等。花型的表现对于植物的传粉和结实会产生影响。
4 ）花性：包括雌雄异株、雌雄同株异花和雌雄同花（两性花）。有些植物在一个植株上既有两性花又有单性花；还有些植物尽管具有两性花，但表现为雄蕊或雌蕊退化。
5 ）花瓣：花瓣的颜色、形态等表现往往与植物的传粉方式和授粉习性有较大的关系。如开花时花瓣紧闭者（金鱼草等）一般采用自花授粉。
6 ）雄蕊和雌蕊：雄性和雌蕊的生长发育状态、着生方式与植物的授粉特点、结实能力等有很大的关系。
7 ）花粉：花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础。同样的两性花品种，花药中产生花粉的多少是不同的，有些很多，有些中等，有些则很少。
六、实验方法与步骤
1．实验准备：查阅资料了解所选的实验材料花器官结构特征和开花授粉习性的相关知识。
2．分组：每 3 ～ 4 人为 1 组，领取实验工具。 3、亲本的选择与选配 4、亲本植株和花朵的选择 5、去雄、套袋 6、花粉采集贮藏 7、授粉
8、杂交后的养护管理 9、杂种种子的采收 七、实验结果分析
1、查阅资料了解几种观赏植物开花授粉的相关知识 美人蕉
花器构造：大而鲜红艳丽部分是5枚特化为花瓣状的雄蕊，其中一枚反卷称“唇瓣”。 3枚长卵形的萼片，3枚披针形、狭而尖的花瓣。
传粉介质：昆虫 开花习性：
2．填写杂交结果记载表 去雄日花粉采授粉日授粉花采种日杂交组合 结果数 种子数 备注 期 集日期 期 数 期 3．根据杂交过程中遇到的问题，你认为影响杂交结果的因素有哪些？ 八、作业及思考题
１．有性杂交过程中如何解决父母本花期不遇问题？ ２．紫鸭子草与美人蕉在杂交技术上有何不同？
实验五、人工诱发植物多倍体
一、实验目的
了解秋水仙素诱导植物多倍体的原理和鉴定多倍体的依据；学习并掌握植物多倍体诱导与鉴定的方法和技术。 二、实验材料
凤仙花、矮牵牛、悬铃木等观赏植物的种子或幼苗。 三、仪器及药品
仪器：显微镜、电子天平、镜台测微尺、目镜测微尺、目镜测微网、培养箱、镊子、刀片、游标卡尺、钢卷尺、载玻片、盖玻片、培养皿、量筒、烧杯、容量瓶、滴管等。
药品：秋水仙素、酒精、蒸馏水、碘、碘化钾、对氯二苯、卡诺固定液、卡宝品红溶液等。 四、实验原理
目前，人工诱导植物多倍体常用秋水仙素溶液进行处理。秋水仙素
（ colchicine ）又称秋水仙碱，是从百合科植物秋水仙中提炼出来的一种植物碱，分子式为 C 22 H 25 O 6 N ，溶于酒精、氯仿和冷水中。秋水仙素诱导多倍体的机理，在于其抑制细胞分裂时微管的聚合过程，阻止纺锤丝的形成，使已分裂的染色体不能迁向细胞的两极，细胞中间也不形成新的核膜，从而形成一个核内染色体加倍的细胞；加倍细胞继续分裂便形成多倍体的组织器官，进而发育成为多倍体植株。
随着植物染色体倍性的变化，其形态和特性也会发生相应的变化。与二倍体相比，多倍体植株常表现叶片宽厚、表面粗糙、叶柄粗短，茎粗枝少，气孔数目减少、保卫细胞变大，叶绿素增加；花、果实、种子等器官较大、花瓣较多、花色浓艳，花粉量减少、花粉粒增大、花粉育性降低，开花和结实期延迟等。因此，除准确地进行花粉母细胞或根尖分生组织细胞的染色体计数外，也可根据形态特征和生长特性对多倍体进行间接的鉴定。 五、实验方法与步骤
1 ．多倍体的诱导
1 ）秋水仙素溶液的配制： 称取 1g 秋水仙素粉末，先溶于少量酒精中，然后加冷水定容至 100ml ，配成 1 ％质量浓度的母液，装于棕色瓶内， 1 ～ 4 ℃冰箱保存备用，使用时再稀释成所需要的浓度。
2 ）秋水仙素处理 ：常用浸渍法、滴液法、涂抹法、注射法、离体法等。可根据处理的组织器官采用其中的一种。
① 浸渍法：可浸渍幼苗、新梢、腋芽、插条、接穗、种子等。对种子进行处理时，先用清水浸种（发芽慢的种子应催芽），使种子处于萌动状态；然后用 0.1% ～ 0.5% 的秋水仙素溶液浸泡种子，一般处理 24h 左右；浸泡后用清水洗净，略阴干后播种，为了促进生根，可在处理液中加入适量的生长素。
② 滴液法：对幼苗进行处理，待子叶展开时，将 0.1% ～ 0.5% 的秋水仙素溶液滴在生长点上，每天早中晚各滴一次，连续处理 2 ～ 3d 。为使药液不会很快蒸发，提高处理效果，可在幼苗生长点处放一脱脂棉球，将秋水仙素溶液滴在棉球上。如天气干燥、蒸发快，中途可滴加蒸馏水保持药液浓度；处理结束后，用清水冲洗数次，将植株上残存药液充分洗净，注意加强管理，并经常观察记载。
园林植物遗传育种学实验指导书
