使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验
一、材料 1、 微载体
GE公司Cytodex 1，25g
2、 生物反应器
上海日泰公司Cellipower 5L，工作体积3.5L 加微载体25g（约7g/L）
3、 细胞、毒种、培养液
二、操作过程
1、 微载体处理、反应罐准备
取微载体25g用PBS溶液洗涤几次后室温下浸泡膨胀过夜。弃去上清液，将载体转移到2L瓶内加入PBS约1L，灭菌后备用。
将微载体装到生物反应罐内，换上新的PBS溶液4L，安装好生物反应罐灭菌（126℃*80min）。 2、 生物反应器校正、调试
反应罐灭菌前调试生物反应器，确保能正常运行，各参数正常。用pH为7.0/10.0的标准缓冲液校正pH电极2次。灭菌后，温度37℃校正DO电极。 3、 预培养
DO电极校正完后，关闭进气，停止搅拌，过15分钟待载体沉降后排空上清液，加入199培养液3 L浸泡处理载体，浸泡3小时后同样关闭进气停止搅拌15分钟后排空上清液，加入7.5%新生牛血清培养液3L，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM，预培养过夜，留意反应器运行是否正常，各参数是否
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稳定能调控。
4、 接种细胞
接种细胞当天先排空反应罐内预培养的7.5%新生牛血清培养液，重新加入7.5%新生牛血清培养液3L，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM。待温度稳定在37℃后取样校正pH值，然后准备接种细胞。
关闭温度、pH、DO控制，关闭进气，搅拌转速设为30RPM，将适量细胞悬液缓缓加入反应罐内，接种细胞总数为1.8*109个（密度约5*105个/ml），温度慢慢调回37℃，接种细胞后2小时开始进气，开启pH、DO控制，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速30RPM。搅拌转速在接种细胞4小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM、6小时后设为60RPM，开始进入细胞培养阶段。
批号定为W20190601
5、 细胞培养
设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM并维持稳定，进行细胞培养。每天取样一次（2管）检测葡萄糖含量、进行显微镜观察。适当调整灌注量，维持葡萄糖含量大于1g/L。
6、 接种病毒
细胞培养4天已长满，进行病毒接种。关闭进气，停止搅拌，过10分钟待载体沉降后排空上清液，加入1%新生牛血清培养液3L，10分钟后排空上清液，再加入1%新生牛血清培养液3L，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速50RPM，待各参数稳定后取样校正pH值。关闭温度、pH、DO控制，关闭进气，搅拌转速设为30RPM，然后将50ml毒种接种入反应罐内。温度慢慢调回35℃，接种病毒后30分钟开始进气，开启pH、DO控制，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅
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拌转速30RPM。搅拌转速在接种病毒3小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM。接种病毒6小时后开始灌注1%新生牛血清培养液7L/天。开灌注前取样。
7、 洗换
接毒第二天先取样，再洗换5次，每次加入199培养液4L，静置10分钟后排空上清液，洗换完加入0.1%人血白蛋白培养液3.5L，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速30RPM。洗换后30分钟开始进气，开启pH、DO控制，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速30RPM。搅拌转速在洗换3小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM。洗换6小时后开始灌注0.1%人血白蛋白培养液7L/天，开始病毒液收获。
8、 病毒液收获
灌注0.1%人血白蛋白培养液7L/天（收获3天后改为5L/天），收获病毒液。收获时每天取样，测抗原并进行显微镜观察。每两、三天的收获液收到一个50L桶内，每桶取样测抗原、DNA、HCP、毒力等。根据抗原检测结果确定收获天数。
9、 下罐
培养结束后下罐，用1.0mol/L NaOH溶液处理反应罐及微载体2小时，再将反应罐、硅胶管等拆除清洗干净后烘干备用。 三、 细胞培养情况
灌注量日期 事项 残糖g/L L 6-13 6-14 6-15 接种细胞 培养1天 培养2天 耗糖量其他 g 3.13 2.56 0 0.7 第 3 页
3.74 2.98 变酸，关CO2开进碱 6-16 培养3天 培养4天，接2.12 2.5 6.19 6-17 毒 2.7 6.5 5.43 凌晨变碱，开CO2关进碱 四、 病毒培养及收获液检测结果 1、 病毒培养情况 日期 6-17 6-18 6-19 6-20 6-21 6-22 6-23 6-24 6-25 事项 洗换 收获1天 收获2天 收获3天 收获4天 收获5天 收获6天 收获7天 收获8天 灌注量L 7 7 7 7 5 5 5 5 5 5 病毒收获液 其他 W20190601①，14L W20190601②，12L W20190601③，15L W20190601④，10L 6-26 收获9天下罐 2、 收获液检测结果
残留HCP.天批号 G抗原 PCR(100pg/ml) 坛 清 W20190601-接毒0.0 449 1.54 4.06 HCP.Cyg 牛血毒力 第 4 页
1d W20190601-收毒0.02 1d W20190601-收毒0.23 2d W20190601-收毒0.71 3d W20190601-收毒1.40 4d W20190601-收毒0.65 5d W20190601-收毒0.73 6d W20190601-收毒0.38 7d W20190601-收毒0.32 8d 1481 1.65 6.44 9148 2.58 10.93 22607 16.13 77886 40071 3.28 14.37 42266 70536 4.61 17.03 W20190601① W20190601② W20190601③ W20190601④ 0.13 0.48 0.54 0.42 610 2282 1341 7029 1.59 1.99 2.9 4.45 1.86 5.73 12.02 11.51 ＞897 ＞219 ＞115 未测 待测 待测 待测 第 5 页
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