二次谐波的应用
二次谐波成像是近年发展起来的一种三维光学成像技术，具有非线性光学成像所特有的高空间分辨率和高成像深度，可避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应。
此外二次谐波信号对组织的结构对称性变化高度敏感，因此二次谐波成像对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测具有很好的生物医学应用前景. 二次谐波 英文名称：second harmonic component
定义：将非正弦周期信号按傅里叶级数展开，频率为原信号频率两倍的正弦分量。
SHG的一个必要条件是需要没要反演对称的介质其次是必须满足相位匹配，传播中的倍频光波和不断昌盛的倍频极化波保持了相位的一致性. 谐波产生的根本原因是由于非线性负载所致。当电流流经负载时，与所加的电压不呈线性关系，就形成非正弦电流，从而产生谐波。
ＳＨＧ实验装置 ＳＨＧ实验装置按二次谐波信号收集方式可分为 前向和后向，图２为前向和后向二次谐波产生的实 验装置示意图．以图２（ａ）为例：由激光器产生 的角频率为 的入射基频光，经过物镜聚焦到样品 上，产生频率为２ 的二次谐波，由另一个高数值 孔径的物镜收集，滤光片（一般为窄带滤光片）滤 掉激发光和可能产生的荧光和其他背景光，再用探 测器件（如ＰＭＴ）和计算机系统进行信号的采集、 存储、分析和显示． 要实现二次谐波 微成像需要对以下因素进行 最优化考虑：超短脉冲激光、高数值孑Ｌ径的显微物 镜、高灵敏度的非解扫面探测器、准相位匹配和具 有高二阶非线性的样品 Ｊ． 激光器：掺Ｔｉ蓝宝石飞秒激光器因具有高重 复频率（８０ ＭＨｚ）和高峰值功率，单脉冲能量低且町在整个近红外区（７００～１ ０００ ｎｍ）内连续调 谐，所以是二次谐波显微成像的理想光源．激光的重复频率对ＳＨＧ也有影响，如果提高激发光的重 复频率，激发光的平均功率可相应提高，二次谐波信号也得到增强．物镜：一般情况下，二次谐波主要非轴向发射，即信号收集时必须有一个足够大的数值孑Ｌ径来 有效接收整个二次谐波信号． 滤光片：为保证所收集的信号为二次谐波信 号，必须使用滤光片．一般采用一长波滤光片和窄 带滤光片（带宽１０ ｎｍ）组合以过滤任何干扰信号． 信号收集系统：为尽晕减少二次谐波信号在系 统中的损失，提高系统的探测灵敏度，最好采用非 解扫（ｎｏｎ．ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）的信号．信号收集系统中的 主要部件是ＰＭＴ探测器．首先，为收集整个二次 谐波信号，需要探测器的接收面足够宽．其次，对 于由可调谐Ｔｉ：蓝宝石飞秒激光器，要接收的二次 谐波信号处于３５０～５００ ｎｍ波段，故可采用双碱阴 极光电倍增管．由于激发光波长离探测器的响应区 很远，故可有效探Ｎ－－次谐波信号． 除了使用不同的滤光片外，二次谐波显微成像 和双光子激发荧光显微成像在系统结构上是完全兼 容的．已有人成功地将激光扫描共聚焦显微镜改造 成双光子系统 ９ ，同样，也可以方便的用改造后的 系统进行两者的复合成像
二次谐波显微成像技术的发展及其在生物医学中的应用.
细胞膜电压的测量对理解细胞信号传递过程有重要作用. 使用合适的膜染剂进行标记, 通过对染剂分子的二次谐波显微成像, 信号强度变化便能反映膜电压的大小.
近年来, 二次谐波显微成像的一个主要领域, 就是发展具有高时空分辨率及高灵敏度的活细胞中横跨膜电压的光学测量方法.
ＳＨＧ成像用于膜电压测量 细胞膜电压的测量对理解细胞信号传递过程有 重要作用．使用合适的膜染剂进行标记，通过对染 剂分子的二次谐波显微成像，信号强度变化便能反 映膜电压的大小．近年来，二次谐波显微成像的一 个主要领域，就是发展具有高时空分辨率及高灵敏 度的活细胞中横跨膜电压的光学测量方法．１９９３ 年，Ｏ Ｂｏｕｅｖｉｔｃｈ等人¨ 证明，所加电场可强烈地 调制ＳＨＧ强度．１９９９年，Ｐ Ｊ Ｃａｍｐａｇｎｏ！ａ等人 则 证明了ＳＨＧ信号随膜电压变化．实验结果表明， 激发波长为
８５０ ｎｍ时，ＳＨＧ对膜电压的灵敏度为 １８／１００ ｍＶ，而ＴＰＥＦ只有１０／１００ ｍＶ＿Ｊ ．２００４年， Ａｎｄｒｅｗ等人进一步研究了苯乙烯基染剂产生的二次 谐波信号对膜电压的敏感性．实验表明，使用８５０ ～９ １０ ｎｍ的激发波长，膜染剂ｄｉ－４．ＡＮＥＰＰＳ和ｄｉ４． ＡＮＥＰＭＰＯＨ使ＳＨＧ对膜电压的敏感度高达２０／１００ ｍＶ，且由于共振增强，使用９５０—９７０ ｎｍ的激发 波长时，敏感度达到４０／１００ ｍＶ ．这些研究结果 进一步巩固了ＳＨＧ在活细胞中膜电压的功能成像 中的重要性． 最近，Ｃｏｒｎｅｌｌ大学的科学家，通过使用一种低 毒性的有机染剂ＤＨＰＥＳＢＰ，对海参神经细胞进行 二次谐波 微成像（如图５），并成功实现了脑组 织巾的电脉冲成像¨ ，这对于解渎大脑工作过程， 解释大脑退化疾病如Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ症等，具有巨大度、高空间分辨率和对生物的低杀伤性特点，为活 体测量提供了一种新方法，有望成为组织形态学和 生理学研究的?个强大工具．目的，ＳＨＧ在神经科 学、药理学及疾病早期 断方面的应用研究已取得 一些进展．但二次谐波成像还是一¨不很成熟的技 术，随着研究的逐步深入，对它的应用仍然有待进 一步的开发．随着微光纤技术的发展，二次谐波成 像技术还可与光纤光学结合进行人体内窥镜检查， 实现活体生物体内深处的组织在分子水平的成像． 随着信号检测技术和计算机技术等的发展，还可运 用二次谐波成像实时观察生物细胞活动．由于二次 谐波显微应用于肌纤维长度的精确度已达到２０ ｎｍ＿¨ ，活体未标记心脏和肌肉组织的纳米药理学 研究也将发挥很大的作用．本实验室正着手研究将 ■次谐波成像、共聚焦显微成像以及双光子激发荧 光成像结合，根据视网膜的分层结构和特点，采用 不 方法成像，进而揭示视网膜的正常生理结构及 病变部位，为视网膜疾病的早期诊断提供一种新型 的具有三维高空间分辨牢的手段
相位匹配及实现方法
实验证明，只有具有特定偏振方向的线偏振光，以某一特定角度入射晶体时，才能获得良好的倍频效果，而以其他角度入射时，则倍频效果很差，甚至完全不出倍频光。根据倍频转换效率的定义
， （15）
经理论推导可得
。 （16）
η与L??k/2关系曲线见图1。图中可看出，要获得最大的转换效率，就要使L??k/2＝0，L是倍频晶体的通光长度，不等于0，故应?k＝0，即
， （17）
就是使
相对光强
， （18）
nω和n2ω分别为晶体对基频光和倍频光的折射率。也就是只有当基频光和倍频光的折射率相等时，才能产生好的倍频效果，式（18）是提高倍频效率的必要条件，称作相位匹配条件。
由于vω＝c/nω，v2ω＝c/n2ω，vω和v2ω分别是基频光和倍频光在晶体中的传播速度。满足（18）式，就是要求基频光和倍频光在晶体中的传播速度相等。从
-2π -π 0 π 2π L??k/
这里我们可以清楚地看出，所谓相位匹配条件的物理实质就是使基频光在晶体中
2
图1 倍频效率与L??k/2的关沿途各点激发的倍频光传播到出射面时，都具有相同的相位，这样可相互干涉增
强，从而达到好的倍频效果。
实现相位匹配条件的方法：由于一般介质存在正常色散效果，即高频光的折射率大于低频光的折射率，如n2ω―nω大约为10－2数量级。?k≠0。但对于各向同性晶体，由于存在双折射，我们则可利用不同偏振光间的折射率关系，寻找到
相位匹配条件，实现?k＝0。此方法常用于负单轴晶体，下面以负单轴晶体为例
说明。图2中画出了晶体中基频光和倍
z 频光的两种不同偏振态折射率面间的
θm 法线 关系。图中实线球面为基频光折射率 面，虚线球面为倍频光折射率面，球面
为o光折射率面，椭球面为e光折射率面，z轴为光轴。
折射率面的定义：从球心引出的每2ωno ω一条矢径到达面上某点的长度，表示晶ωne no 体以此矢径为波法线方向的光波的折O 射率大小。实现相位匹配条件的方法之 一是寻找实面和虚面交点位置，从而得
2ω到通过此交点的矢径与光轴的夹角。图ne 中看到，基频光中o光的折射率可以和 倍频光中e光的折射率相等，所以当光
图2 负单轴晶体折射率球面 波沿着与光轴成θm角方向传播时，即 可实现相位匹配，θm叫做相位匹配角，θm可从下式中计算得出
， (19)
式中都可以查表得到，表1列出几种常用的数值。
表1 相位匹配角 晶体 铌酸锂 碘酸锂 KD*P λ/μm no ne 3057′ oθm 87 2930′ oo注意，相位匹配角是指在晶体中基频光相对于晶体光轴z方向的夹角，而不是与入射面法线的夹角。为了减少反射损失和便于调节，实验中一般总希望让基频光正入射晶体表面。所以加工倍频晶体时，须按一定方向切割晶体，以使晶体法线方向和光轴方向成θm，见图3。
以上所述，是入射光以一定Z θm 角度入射晶体，通过晶体的双 折射，由折射率的变化来补偿基频光ω 晶面法线 正常色散而实现相位匹配的， 晶体
这称为角度相位匹配。角度相
位匹配又可分为两类。第一类图3 非线性晶体的切割
是入射同一种线偏振光，负单
轴晶体将两个e光光子转变为一个倍频的o光光子。第二类是入射光中同时含有o光和e光两种线偏振光，负单轴晶体将两个不同的光子变为倍频的e光光子，正单轴晶体变为一个倍频的o光光子。见表2
表2 单轴晶体的相位匹配条件 晶体种类 第一类相位匹配 第二类相位匹配
次谐波相位匹配及其实现方法
