1. 微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。
定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性功能，运用重组DNA技术来创造新的化合物。
研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。
研究手段：代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技术方面主要有下列三大常用手段：
(1)检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。
(2)分析技术：采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结计算机技术，阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。
(3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。
2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。
代谢改造思路：
根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。
(1)改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。
(2)扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。
(3)转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理：
现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流：增加限速酶编码基因的拷贝数；强化关键基因的表达系统；提高目标途径激活因子的合成速率；灭活目标途径抑制因子的编码基因；阻断与目标途径相竟争的代谢途径；改变分支代谢途径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢途径；
在现存途径中改变物流的性质：利用酶对前体库分子结构的宽容性；通过修饰酶分子以拓展底物识别范围；
在现存途径基础上扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。
3. 微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明）
微生物的基因操作技术有：核酸的凝胶电泳、核酸的分子杂交技术、DNA序列分析、基因的定点诱变、细菌的转化、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究、PCR技术等。
基因定点突变(site-directed mutagenesis)：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。主要采用两种PCR方法，包括重叠延伸技术和大引物诱变法。在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性的研究中，采用定点突变技术，对编码221位和228位氨基酸的DNA序列进行突变，改变两
个位点的氨基酸，从而研究氨基酸残基对底物结合的影响。
基因敲除(gene knock-out)：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点，可分为完全基因敲除和条件型基因敲除。在谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的研究中，采用基因敲除的方法进行高产菌株构建。如ilvA基因敲除，使苏氨酸脱氨酶的合成减少，降低异亮氨酸合成的前体，从而减少异亮氨酸的合成，增加缬氨酸的生成。
4. 什么是酶的反馈抑制，以缬氨酸代谢途径来举例说明。
酶的反馈抑制：指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用，包括顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。
以缬氨酸为例：缬氨酸由丙酮酸合成，涉及四个反应，分别由四个酶催化，依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。首先，由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸；其次，AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸；再次，由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸；最后，TA将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸。L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。
缬氨酸合成反馈抑制的主要对象是其合成途径上的第一个关键酶乙酰羟酸合酶（AHAS），同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除AHAS的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。如抗缬氨酸突变株的获得，或者利用分子手段对关键酶基因进行定点突变。
5. 微生物酶的自动调节方式（举两例说明）。
微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成的全部酶，在一定生理条件下只合成它当时所需要的酶，且酶的活力受到控制。微生物主要在转录水平、翻译水平、蛋白质水平、不同空间分布和细胞水平上进行酶的调节，此外对信号传导的响应也起到调节作用。 （1）以转录水平上营养阻遏机制为例来说明酶的调节：
转录水平上的调节是通过调节酶量进行的。在细胞培养过程中，当培养基中含有能被细胞迅速利用的碳源（如葡萄糖）时，其在降解过程中的某代谢产物阻遏了其余降解酶系的合成，这种现象被称为“降解物阻遏”。 环腺苷酸受体蛋白（CRP）能与环腺苷酸（cAMP）结合形成cAMP-CRP复合物。当cAMP-CRP结合于DNA时，能促进RNA聚合酶与启动子结合，从而促进转录。葡萄糖分解代谢物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓度，不能形成cAMP-CRP复合物，降低了各种酶蛋白基因的转录，起到调节相关代谢酶的作用。 （2）以蛋白质水平上酶的共价修饰为例来说明酶的调节：
酶的共价修饰时调节酶活性的重要方式，通过其他酶对多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶的活性，如磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。
磷酸化酶激酶催化的反应既可以是通过磷酸化作用使无活性的磷酸化酶b转化为有活性的磷酸化酶a ，也可以是通过磷酸化酶磷酸酶的水解作用使磷酸化酶a脱去磷酸而转化为无活性的磷酸化酶b。
6. 微生物基因水平的调控策略，请举例说明
基因调控是生物体内控制基因表达的机制。基因表达的主要过程是基因的转录和信使核糖核酸(mRNA)的翻译。基因调控主要发生在三个水平上,即①DNA水平上的调控、转录控制和
翻译控制；②微生物通过基因调控可以改变代谢方式以适应环境的变化，这类基因调控一般是短暂的和可逆的；③多细胞生物的基因调控是细胞分化、形态发生和个体发育的基础,这类调控一般是长期的,而且往往是不可逆的。基因调控的研究有广泛的生物学意义，是发生遗传学和分子遗传学的重要研究领域。原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。真核生物的基因调控比原核生物复杂得多。 (1)负控诱导系统：大肠杆菌的lac i基因与乳糖操纵子（lactose operon）的作用是典型的负控诱导系统。在这个系统中，i基因是调节基因，当它的产物——阻遏蛋白与操纵区（lac O）结合时，RNA聚合酶便不能转录结构基因，因此，在环境中缺乏诱导物（乳糖或IPTG）时，乳糖操纵子是受阻的。而当环境中有乳糖时，进入细胞的乳糖在细胞内尚存在的极少量的β-半乳糖苷酶的作用下而发生分子重排，由乳糖变成异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白紧密结合，使后者的构型发生改变而不能识别lac O，也不能与之结合，因而RNA聚合酶能顺利转录结构基因，形成大分子的多顺反子mRNA，继而在翻手水平上合成三种不同的蛋白质：β-半乳糖苷酶、透性酶以及乙酰基转移酶。
（2）负控阻遏系统：大肠杆菌色氨酸操纵子（tryptophan operon）含有5个结构基因，编码色氨酸生物合成途径中的 5种酶。这些基因从一个启动子起始转录出一条多顺反子的mRNA，与lac操纵子一样，这个启动子受毗邻的操纵区顺序控制。转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制的，它的效应物分子是色氨酸，也就是由trρ操纵子的基因所编码的生物合成途径中的末端产物。当色氨酸很丰富时，它结合到游离的阻遏物上诱发变构转换，从而使阻遏物紧紧结合在操纵区。另一方面，当色氨酸供应不足时，阻遏物失去了所结合的色氨酸，从操纵区上解离下来，trρ操纵子的转录就此开始。色氨酸起着trρ操纵子的辅阻遏物功能。 （3）染色质丢失：在发育过程中一些体细胞失去了某些基因，这些基因便永不表达，这是一种极端形式的不可逆的基因调控。在某些线虫、原生动物、甲壳动物发育过程中的体细胞有遗传物质丢失现象。在这些生物中，只有生殖细胞才保留着该种生物基因组的全套基因。例如在马副蛔虫(Ascaris megacephala)卵裂的早期就发现有染色体的丢失现象。蜜蜂的工蜂和蜂后是二倍体，而单倍体则发育成为雄蜂。这也可以认为是一种通过染色体丢失的基因调控。 7. 如何采用代谢工程进行缬氨酸育种？
答案一
缬氨酸生物合成过程分别由四个酶催化，分别为乙酰羟酸合酶(AHAS，ilvBN基因产物)、 乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR，ilvC基因产物)、二羟酸脱水酶(DHAD，ilvD 基因产物)和支链氨基酸转氨酶(TA，ilvE基因产物)。
1)缬氨酸生物合成的调节，通常采取的方法是用多拷贝质粒表达ilvBNC、ilvD和ilvE基因。
2)运用启动子的强弱来控制基因的表达。这个策略避免了两个极端，避免了太强的基因过表达会对给菌体本身带来压力，也避免了通过基因敲除会彻底切断支路或者相互竞争的路径带来的麻烦。运用不同强度的启动子，能够保证涉及生物合成的所有基因都会表达在最适宜的代谢流量。
3)切断或改变平行代谢途径：缬氨酸和异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成 途径中公用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨酸的产量。
4)解除菌体自身的反馈抑制：缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制，同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。
5)增加前体物质的合成：生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的缬氨酸，必须
提高丙酮酸的产量。通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性都可以来增加丙酮酸的积累。
答案二
工业发酵若想获得较高产量的目的产物，必须突破（或解除）微生物细胞自我调节控制机制，最常用且最有效的方法就是从遗传的角度选育解除微生物正常代谢调节机制的突变株。L-缬氨酸发酵生产的代谢调控育种的基本途径有：切断或改变平行代谢途径（选育营养缺陷型突变株），解除菌体自身的反馈抑制（选育抗反馈调节突变株），选育营养缺陷型恢复突变株，增加前体物质的合成，切断进一步代谢途径和利用基因工程技术构建缬氨酸工程菌。
(1)切断或改变平行代谢途径
由图，缬氨酸和异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成途径中公用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨酸的产量。
同时α-乙酰异戊酸是合成缬氨酸和亮氨酸的共同前体物。切断亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使α-异丙基苹果酸合成酶脱敏显著提高缬氨酸的产量。
通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性来切断与缬氨酸合成无关的代谢流分支对碳源的消耗。使碳架物质相对集中地流向缬氨酸。
2)解除菌体自身的反馈抑制
缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制，同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。常用的缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、缬氨酸等。
(3)增加前体物质的合成
由图可以看出生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量。通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性都可以来增加丙酮酸的积累。
根据上述选育突变株的几条途径可选育组合型突变株，如营养缺陷型突变株和抗性结构类似物双重突变株，以提高目的产物的产量。
8. 简述工业发酵的五字策略。（结合研究实例说明） 工业发酵的五字策略为“进、通、节、堵、出”，含义分别为：进，促进细胞对碳源等营 养物质的吸收；通，使来自代谢流上游和各个“注入分支”的碳架物质能畅通地流向目的产物；节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；出，促进目的产物向胞外空间分泌。 通：缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成途径中公用了三种酶，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨酸的产量。
节：通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株来增加缬氨酸前提物质丙酮酸的积累。 通过敲出编码苏氨酸脱氢酶的ilvA基因，可以阻断亮氨酸和泛酸的合成，他们与缬氨酸竞争前体物质酮异戊酸。通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性来阻断与缬氨酸合成无关的碳硫分支对碳源的消耗。阻塞与缬氨酸形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向缬氨酸
堵：缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌的育种过程中，筛选终产物分解抑制菌株，达到提高产物的目的。
出：通过抑制相应运输载体蛋白基因的表达，从而抑制缬氨酸向胞内运输载体蛋白的表达，促进目的产物向胞外空间分泌。 9 简述微生物基因克隆的方法与流程
答案一：
1. 鸟枪法：将某种微生物的全部基因组切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从而筛选出含有目的基因的期望重组子。基本程序1）目的基因DNA片段的制备，有机械法和限制性内切酶切割法2）外源DNA片段全克隆3）期望重组子的筛选4）目的基因的定位 2. cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆。基本程序：1）mRNA的分离纯化双链cDNA的克隆3）cDNA重组克隆的筛选
3. PCR扩增法：在DNA单链模板、引物、DNA聚合酶以及缓冲体系中，根据生物DNA复制原理在体外合成DNA。操作步骤：1）将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模板2）加入两种不同的单链DNA引物，并分别与两条单链DNA模板退火3）DNA聚合酶从两个引物的3’羟基端按照模板要求合成新生DNA链，构成一轮复制反应重复上述操作n次，即可从1分子的双链DNA扩增到2n个分子。
4. 化学合成法：对于几十个碱基的小片段目的基因序列，可以分别直接合成气两条互补链，然后退火即可。而大片段双链DNA或目的基因合成通常采用单链小片段DNA模块拼接的方法，有三种基本形式，小片段粘接法、补丁延长法和大片段酶促法。
5. 基因文库法：将微生物的全部基因分成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受体细胞中，形成一套含有微生物全基因组的DNA片段克隆，即基因文库。这样就可以从基因文库中点出其中任何的DNA片段或目的基因。
答案二
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