《食品安全与卫生学》实验设计
( 专业)
分组号:
设计者:
参与者:
1
时 间:
2
实验一 “鲜肉的质量评价”综合实验
设计内容:以市售鸡肉样品为目标,参考课件、食品专业实验指导教材、肉品检验相关教材、相关食品检测国家标,主要针对取样方法、感官检验、理化分析(pH计测定酸度、硫酸铜法测球蛋白)、微生物检验(大肠菌群国标法1/试管法)、兽药的免疫学快速检测(环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法)等内容,从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程,具
体顺序不做要求,但应具体、有可操作性,并在规定的时间内完成上述全部内容,给出实验结果和综合判定。
一、 鸡肉的取样方法:
先将检样进行表面消毒(沸水内烫3s—5s,或烧灼消毒),再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g,放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后,加灭菌海砂或玻璃砂研磨,磨碎后加入灭菌水225mL,混匀,即为1︰10稀释液
二、 鸡肉的感官检验:
原理:肉在发生腐败变质时,会发生改变色泽,气味和硬度的现象,并形成气味。 方法:
1,视觉检查:自然光线下,观察肉的表面形态和色泽,以及有无血块、霉斑污染物,然后用刀顺肉纤维方向切开,观察断面色泽。
2,嗅觉检查:常温下嗅其气味。
3,硬度检测:在食指按压肉表面,触感其硬度指压凹陷恢复速度,或是否恢复。表面干湿及是否发粘。
色泽 肌肉有光泽。红色均匀,粘度 外表微干或微湿润,或有风弹性 指压后凹陷立即恢复 其他 评定结果 一级鲜度 脂肪洁白或淡黄 干膜,不粘手 肌肉色稍暗,切面尚有光泽,新切面湿润 脂肪呈灰表面高度干外表干燥或粘手 指压后凹陷恢复慢且不能立即恢复 指压凹陷不恢复 肉品表面到深层都有腐败气味 腐败肉 稍有氨味或酸味 二级鲜度 色,切面深灰色、燥,指压粘手 浅绿色 三、鸡肉的理化检验:
制备肉浸液:肉样表层或深层取20-30g肉,除去脂肪和筋腱,切碎。称取10g碎肉放于250mL烧杯中,加入预煮蒸馏水(无氨蒸馏水)100mL,静置30min,每隔5min用玻璃棒搅拌一次,然后用滤纸过滤至100mL的三角瓶中备用。
1、pH计测定酸度
原理:肉类腐败是,蛋白质分解成氨和胺等碱性物质,使肉的酸度降低,肉的pH值变
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化在一定程度上反映了肉的新鲜度。
1.仪器与药品:天平 ,刀, 250mL,烧杯, 100mL三角瓶 ,100mL量筒 ,10mL烧杯, 温度计, 脱脂棉, 酸度计, pH缓冲液。
2.方法:用酸度计测定肉浸液的pH值。
评定标准:鲜肉: 次鲜肉: 腐败肉:以上 2、球蛋白沉淀试验
原理:肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度随pH值升高而增大在肉的腐败过程中,pH值升高。蛋白质在碱性溶液中能与重金属离子形成沉淀。因此,可根据形成沉淀的情况判断肉的新鲜度。
(1) 仪器与药品:10%的硫酸铜溶液
肉浸液的制备:将肉羊捣碎,混匀,称取于锥形瓶内,加入100mL蒸馏水,摇匀,浸渍30min,过滤即得到待测肉浸液。
(2) 测定:在一支5mL试管中加入2mL肉浸液,在另一支试管中加入2mL蒸馏水作为对照。然后分别加入5滴10%硫酸铜溶液,充分振荡后观察。
(3) 判断:试管中液体呈淡蓝色,并且透明,是新鲜肉,液体轻度浑浊或少量混悬物为次鲜肉,液体浑浊并有白色沉淀为变质。 四、 微生物检验: 操作步骤: (1).样品的准备:
1.称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min----10000r/min均质1min----2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min---2min,制成1:10的样品溶液。 2. 样品匀液的pH值应在之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。 3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL盐酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(吸管不要触及稀释液面),,振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。
4.根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全程不得超过15min。
(2)初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管桂基硫酸盐蛋白胨肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL则用双料LST肉汤),36℃培养24h,管擦倒管内是否有气泡产生,24h产气者进行复发酵实验,如未产气则继续培养至48h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 (3)复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)
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管中,36℃培养48h。观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。 五、环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法 1 材料与方法
1. 1 试剂 CPFX, 纯度大于99. 7%; CPFX 单克隆抗体, 包被抗原( OVACPFX); 联苯二胺( POD) , 牛血清白蛋白( BSA) ,; 酶标羊抗小鼠IgG; 乙腈、三乙胺; 其他试剂为国产分析纯。
1. 2 CPFX 标准溶液配制
CPFX 标准品储液:CPFX 标准品5 mg, 用0. 03 mol / L NaOH 溶液溶解并稀释成1 g / L 的储备液, 置2~8℃冰箱中保CPFX 标准品工作液: 准确量取适量CPFX 标准储备液, 用乙腈稀释成适宜浓度的标准工作溶液。
1.
3 样品前处
分别取鸡的腿部肌肉组织2 g,用少量磷酸盐缓冲液( pH7. 0) 研磨至匀浆, 每个样品均添加CPFX 标准品溶液, 并设定1. 25× 10- 3、6. 25×10- 4、3. 125×10- 4、1. 562 5×10- 4 g / kg 4 个添加水平, 另设一个空白。用磷酸盐缓冲液振荡混合, 离心, 定容至25 mL 成为备用液[ 。取备用液用正己烷脱脂作为ELISA 检测的试样溶液[ ; 取备用液用SPE 小柱萃取作为HPLC 检测的试样溶液 。. ELISA 方法检测样品中的CPFX
1. 4. 1 间接竞争ELISA 方法的建立[ 4] 包被抗原( OVA-CPFX) 用包被液( pH9. 6, 0. 05 mol / L 碳酸盐缓冲液) 稀释至1 mg / L 加入酶标板, 每孔100 μL,37℃反应2 h; 用洗液( pH7. 4, 0. 01 mo l/ L PBSTween 20) 洗3 次, 每次3 min。将腹水单抗18 000倍稀释与适当梯度稀释的标准CPFX 溶液各50μL 同时加入酶标板内, 37℃反应1 h; 洗板3 次后, 加入4 000 倍稀释的酶标二抗, 每孔100μL, 37℃反应1h; 洗板4 次后, 加底物溶液( OPD) 每孔100μL, 37℃反应15 min, 加终止液( 2 mo l/ L H2SO4 ) , 每孔50μL, 通过酶标仪测定D 490值。
1. 4. 2 ELISA 标准曲线的制作
准确量取适量CPFX 标准品储液, 分别稀释成400、200、100、50、25、12. 5、6. 25、0 ??g/ L 的CPFX 标准溶液, 按1. 4. 1的方法进行ELISA, 以标准品浓度的常用对数为横坐标, 以抑制率( A标/ A0 )%为纵坐标绘制标准曲线。做标准曲线的同时, 在一块包被好的酶标板, 随机选择10 个孔做零标准品间接竞争ELISA 检测。求所得10 个D 值的标准差( s) , 在标准曲线上对应
( A0-2s) 的标准品浓度即为此方法的最低检测限( 注: A 0为零标准品( 不添加标准品) 孔D 值, A标为各浓度标准品孔D 值) 。
1. 4. 3 样品中CPFX 的检测及CPFX 回收率测定
用ELISA 试样溶液进行间接竞争ELISA 检测, 每个水平重复测定5 次, 根据间接竞争ELISA 标准曲线的回归方程计算CPFX 的测量值, 用测量值( 扣除空白) 与实际值相除, 即为样品的回收率。
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食品安全与卫生学实验设计鲜肉及生鲜牛乳质量评价
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