《食品安全与卫生学》实验设计
（ 专业）
分组号:
设计者:
参与者:
1
时 间:
2
实验一 “鲜肉的质量评价”综合实验
设计内容：以市售鸡肉样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、肉品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（pH计测定酸度、硫酸铜法测球蛋白）、微生物检验（大肠菌群国标法1/试管法）、兽药的免疫学快速检测（环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具
体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。
一、 鸡肉的取样方法：
先将检样进行表面消毒（沸水内烫3s—5s，或烧灼消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1︰10稀释液
二、 鸡肉的感官检验：
原理：肉在发生腐败变质时，会发生改变色泽，气味和硬度的现象，并形成气味。 方法：
1，视觉检查：自然光线下，观察肉的表面形态和色泽，以及有无血块、霉斑污染物，然后用刀顺肉纤维方向切开，观察断面色泽。
2，嗅觉检查：常温下嗅其气味。
3，硬度检测：在食指按压肉表面，触感其硬度指压凹陷恢复速度，或是否恢复。表面干湿及是否发粘。
色泽 肌肉有光泽。红色均匀，粘度 外表微干或微湿润，或有风弹性 指压后凹陷立即恢复 其他 评定结果 一级鲜度 脂肪洁白或淡黄 干膜，不粘手 肌肉色稍暗，切面尚有光泽，新切面湿润 脂肪呈灰表面高度干外表干燥或粘手 指压后凹陷恢复慢且不能立即恢复 指压凹陷不恢复 肉品表面到深层都有腐败气味 腐败肉 稍有氨味或酸味 二级鲜度 色，切面深灰色、燥，指压粘手 浅绿色 三、鸡肉的理化检验：
制备肉浸液：肉样表层或深层取20-30g肉，除去脂肪和筋腱，切碎。称取10g碎肉放于250mL烧杯中，加入预煮蒸馏水（无氨蒸馏水）100mL，静置30min，每隔5min用玻璃棒搅拌一次，然后用滤纸过滤至100mL的三角瓶中备用。
1、pH计测定酸度
原理：肉类腐败是，蛋白质分解成氨和胺等碱性物质，使肉的酸度降低，肉的pH值变
3
化在一定程度上反映了肉的新鲜度。
1.仪器与药品：天平 ，刀， 250mL，烧杯， 100mL三角瓶 ，100mL量筒 ，10mL烧杯， 温度计， 脱脂棉， 酸度计， pH缓冲液。
2.方法：用酸度计测定肉浸液的pH值。
评定标准：鲜肉： 次鲜肉： 腐败肉：以上 2、球蛋白沉淀试验
原理：肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度随pH值升高而增大在肉的腐败过程中，pH值升高。蛋白质在碱性溶液中能与重金属离子形成沉淀。因此，可根据形成沉淀的情况判断肉的新鲜度。
（1） 仪器与药品：10%的硫酸铜溶液
肉浸液的制备：将肉羊捣碎，混匀，称取于锥形瓶内，加入100mL蒸馏水，摇匀，浸渍30min，过滤即得到待测肉浸液。
（2） 测定：在一支5mL试管中加入2mL肉浸液，在另一支试管中加入2mL蒸馏水作为对照。然后分别加入5滴10%硫酸铜溶液，充分振荡后观察。
（3） 判断：试管中液体呈淡蓝色，并且透明，是新鲜肉，液体轻度浑浊或少量混悬物为次鲜肉，液体浑浊并有白色沉淀为变质。 四、 微生物检验： 操作步骤： （1）.样品的准备：
1.称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min----10000r/min均质1min----2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min---2min，制成1：10的样品溶液。 2. 样品匀液的pH值应在之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。 3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL盐酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（吸管不要触及稀释液面），，振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
4.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全程不得超过15min。
（2）初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管桂基硫酸盐蛋白胨肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL则用双料LST肉汤），36℃培养24h，管擦倒管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵实验，如未产气则继续培养至48h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 （3）复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
4
管中，36℃培养48h。观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 五、环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法 1 材料与方法
1. 1 试剂 CPFX, 纯度大于99. 7%; CPFX 单克隆抗体, 包被抗原( OVACPFX); 联苯二胺( POD) , 牛血清白蛋白( BSA) ,; 酶标羊抗小鼠IgG; 乙腈、三乙胺; 其他试剂为国产分析纯。
1. 2 CPFX 标准溶液配制
CPFX 标准品储液:CPFX 标准品5 mg, 用0. 03 mol / L NaOH 溶液溶解并稀释成1 g / L 的储备液, 置2～8℃冰箱中保CPFX 标准品工作液: 准确量取适量CPFX 标准储备液, 用乙腈稀释成适宜浓度的标准工作溶液。
1.
3 样品前处
分别取鸡的腿部肌肉组织2 g,用少量磷酸盐缓冲液( pH7. 0) 研磨至匀浆, 每个样品均添加CPFX 标准品溶液, 并设定1. 25× 10- 3、6. 25×10- 4、3. 125×10- 4、1. 562 5×10- 4 g / kg 4 个添加水平, 另设一个空白。用磷酸盐缓冲液振荡混合, 离心, 定容至25 mL 成为备用液[ 。取备用液用正己烷脱脂作为ELISA 检测的试样溶液[ ; 取备用液用SPE 小柱萃取作为HPLC 检测的试样溶液 。. ELISA 方法检测样品中的CPFX
1. 4. 1 间接竞争ELISA 方法的建立[ 4] 包被抗原( OVA-CPFX) 用包被液( pH9. 6, 0. 05 mol / L 碳酸盐缓冲液) 稀释至1 mg / L 加入酶标板, 每孔100 μL,37℃反应2 h; 用洗液( pH7. 4, 0. 01 mo l/ L PBSTween 20) 洗3 次, 每次3 min。将腹水单抗18 000倍稀释与适当梯度稀释的标准CPFX 溶液各50μL 同时加入酶标板内, 37℃反应1 h; 洗板3 次后, 加入4 000 倍稀释的酶标二抗, 每孔100μL, 37℃反应1h; 洗板4 次后, 加底物溶液( OPD) 每孔100μL, 37℃反应15 min, 加终止液( 2 mo l/ L H2SO4 ) , 每孔50μL, 通过酶标仪测定D 490值。
1. 4. 2 ELISA 标准曲线的制作
准确量取适量CPFX 标准品储液, 分别稀释成400、200、100、50、25、12. 5、6. 25、0 ??g/ L 的CPFX 标准溶液, 按1. 4. 1的方法进行ELISA, 以标准品浓度的常用对数为横坐标, 以抑制率( A标/ A0 )%为纵坐标绘制标准曲线。做标准曲线的同时, 在一块包被好的酶标板, 随机选择10 个孔做零标准品间接竞争ELISA 检测。求所得10 个D 值的标准差( s) , 在标准曲线上对应
( A0-2s) 的标准品浓度即为此方法的最低检测限( 注: A 0为零标准品( 不添加标准品) 孔D 值, A标为各浓度标准品孔D 值) 。
1. 4. 3 样品中CPFX 的检测及CPFX 回收率测定
用ELISA 试样溶液进行间接竞争ELISA 检测, 每个水平重复测定5 次, 根据间接竞争ELISA 标准曲线的回归方程计算CPFX 的测量值, 用测量值( 扣除空白) 与实际值相除, 即为样品的回收率。
5
食品安全与卫生学实验设计鲜肉及生鲜牛乳质量评价
