(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是____________，原因
是
________________________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由______________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是____________。
(5)若选用Sephadex G－75，则“G”表示____________________，75表示______________________。
答案 (1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶间隙移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网和尼龙纱
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定
(5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g
解析 (1)用凝胶色谱技术分离各种不同蛋白质时，大分子物质由于直径较大，只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶
颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒内，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，所以大分子物质先洗脱出来。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由尼龙网和尼龙纱替代。
(3)在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
(4)洗脱液应与浸泡凝胶所用液体相同，且洗脱液流速要稳定，以免干扰洗脱结果。
3．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2和CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：
(1)血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：________、粗分离、________和________。
(2)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①
加
入
柠
檬
酸
钠
的
目
的
是
________________________________________________________________________。
②以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、________、分离血红蛋白溶液。
(3)收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是______________。 (4)然后通过________法将样品纯化，样品纯化的目的是____________________。最后经____________________进行纯度鉴定。
(5)电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的________、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
答案 (1)样品处理 纯化 纯度鉴定 (2)①防止血液凝固 ②血红蛋白的释放 (3)透析
(4)凝胶色谱 去除大分子杂质蛋白 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 (5)大小
解析 (1)血红蛋白提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
(2)①采取血液时要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，以防止血液凝固。②样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。
(3)将收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析进行样品的粗分离。
(4)通过凝胶色谱法将样品纯化，纯化的目的是去除大分子杂质蛋白，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
(5)电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
比较琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
方向真题体验
1．(2018·江苏高考)下列关于酵母细胞固定化实验的叙述，正确的是( ) A．用温水使海藻酸钠迅速溶解，待其冷却到室温后用于包埋细胞 B．进行包埋时，用于悬浮细胞的CaCl2溶液浓度要适宜
C．注射器(或滴管)出口应尽量贴近液面以保证凝胶珠成为球状 D．包埋酵母细胞的凝胶珠为淡黄色半透明状，并具有一定的弹性 答案 D
解析 在酵母细胞固定化实验中，应该用小火、间断加热的方式使海藻酸钠缓慢溶解，A错误；将混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液进行固定化酵母细胞，CaCl2的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠，B错误；注射器(或滴管)出口应与液面保持适当的距离，以保证凝胶珠成为球状，C错误；包埋酵母细胞的凝胶珠为淡黄色半透明状，并具有一定的弹性，D正确。
2．(2016·江苏高考)(多选)为了使牛仔裤呈现“穿旧”效果，在工业洗衣机中用酶洗代替传统的浮石擦洗，是目前重要的生产手段(工艺流程见下图)。下列叙述中错误的是( )
A．纤维素酶在仿旧中的作用机理与其在洗衣粉中去污的机理相似 B．在上述工艺中，为重复使用纤维素酶，可选用适当的包埋剂固定化酶 C．在上述工艺中，通过调节温度、酸碱度、处理时间可控制仿旧颜色的深浅
D．纤维素酶催化葡萄糖残基间磷酸二酯键的水解分解纤维素 答案 BD
解析 纤维素酶在仿旧中的作用机理是适当分解布料中的纤维素成分，洗衣粉中添加纤维素酶的作用机理是适当分解布料中的纤维素成分使织物膨松，有利于去污，两者作用机理相似，A正确；酶分子较小，容易从包埋材料中漏出，一般采用化学结合法或物理吸附法固定化酶，B错误；温度、酸碱度会影响酶的活性，处理时间会影响酶的作用效果，故通过调节温度、酸碱度和处理时间可控制仿旧颜色的深浅，C正确；纤维素分子中不含磷酸二酯键，D错误。
3．(2015·江苏高考)下列关于酶的叙述，正确的是( )
A．发烧时，食欲减退是因为唾液淀粉酶失去了活性 B．口服多酶片中的胰蛋白酶可在小肠中发挥作用 C．用果胶酶澄清果汁时，温度越低澄清速度越快 D．洗衣时，加少许白醋能增强加酶洗衣粉中酶的活性 答案 B
解析 发烧时食欲减退是因为体温升高抑制了消化酶的活性，但还没引起唾液淀粉酶失去活性，A错误；口服的多酶片中胰蛋白酶往往在内层，可到达小肠中发挥作用，B正确；低温会使果胶酶的活性受到抑制，只有在最适温度时酶的活性最高，果汁澄清的速度才最快，C错误；加酶洗衣粉中含有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶等，白醋呈酸性，会使pH降低，更加偏离酶的最适pH，因此，加白醋会降低酶的活性，D错误。
4．(2015·山东高考)乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，具有重要应用价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如下：
产乳糖酶 产乳糖酶乳糖酶的乳糖酶的―→―→―→
微生物L的筛选微生物L的培养提取纯化固定化(1)筛选产乳糖酶的微生物L时，宜用________作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼脂的作用是________。从功能上讲，这种培养基属于________。
(2)培养微生物L前，宜采用________方法对接种环进行灭菌。
(3)纯化后的乳糖酶可用电泳法检测其分子量大小。在相同条件下，带电荷相同的蛋白质电泳速度越快，说明其分子量越________。
(4)乳糖酶宜采用化学结合法(共价键结合法)进行固定化，可通过检测固定化乳糖酶的________确定其应用价值。除化学结合法外，酶的固定化方法还包括________、________、离子吸附法及交联法等。
答案 (1)乳糖 凝固剂 选择培养基 (2)灼烧 (3)小
(4)(酶)活性[或：(酶)活力] 包埋法 物理吸附法(注：两空可颠倒) 解析 (1)该培养基中的唯一碳源应为乳糖，只有能利用乳糖的微生物能在该
第11单元 第41讲 酶的应用和蛋白质的提取和分离-2021届高考一轮复习生物讲义
