1.诱变剂的选择
? 对于低产或野生菌，uv线往往是首选，烷化剂等也是常用的诱变剂；对于经多次诱变处理的
菌株，常需要强辐射进行处理。
? 碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复 ? 细胞的透性和生理状态
? 经常变换诱变剂或复合处理
3 处理方法
? 单一诱变剂处理; ? 复合处理
（四）后培养
? 目的使突变基因纯合并表达，消除表型延迟。 ? 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各
种生长因子。
（五）变异菌株的分离及筛选
? 筛选：包括初筛，复筛和终筛等。
? 明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等； ? 一次诱变目标不要太高
? 制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌
株；每一步准备采用的分析方法等。
诱变育种工作中应注意的问题
? 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。
? 个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如γ-射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；
? 环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。 ? 要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。 ? 诱变育种技术要和其他育种手段相结合。
? 诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。 二 、营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型（auxotroph）突变株：
是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。
营养缺陷型突变株的用途
? 科研上：
?研究代谢途径；
?基因重组的遗传标记菌种；
?AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 ? 生产上：
?发酵法生产氨基酸，核苷酸的生产菌种； ?生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记
(一) 筛选方法 ? 后培养
? 淘汰野生型 ? 检出缺陷型 ? 鉴定缺陷型
1、淘汰野生型
? 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后
被除去
? 方法：
? 抗生素法：
? 菌丝过滤法：适用于丝状真菌 ? 差别杀菌：
抗生素淘汰野生型
? ?
饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养1-2小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”；
加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。
? ?
制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。
注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。
2、检出缺陷型 1）限量补充法 2）夹层培养法 3）逐个检出法 4）影印培养法
3、鉴定缺陷型----生长谱法
?大类的鉴定：
?营养因子：
A、酪素水解液（AA混合物） B、水溶性维生素混合液
C、酵母核酸水解液（碱基） D、酵母膏水溶液
?制备平板：缺陷型菌经CM液体培养后，离心洗涤，制成107~108个/ml菌悬液。取0.1ml涂布至MM平板上
?方法：分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的MM上，适宜温度下培养 ?判断： A、D生长，AA缺陷型
B、D生长，维生素缺陷型 C、D生长，碱基缺陷型 A~B、D生长，AA、维生素双缺 A~C、D生长，AA、碱基双缺
B~C、D生长，维生素、碱基双缺
营养缺陷型的生长谱鉴定
不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平
三、 其它类型突变型的筛选
（一）抗代谢类似物突变型的筛选
? 抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有
之的突变株。
? 代谢类似物：结构与代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用的一类化合物。
1、抗反馈抑制突变
? 发生基因突变的细胞：酶的结构基因发生突变导致调节酶的调节部位发生改变，不再与结构
类似物（或产物）结合，从而解除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合成。
突变前 突变后 抗反馈
抑制突变的机制
2、抗反馈阻遏突变型
?
由于调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得以过量积累。
3、 筛选方法
（1）将经过诱变的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株；
（2）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株；
注意：
? 如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物
? 抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提
高
结构类似物和代谢终产物
（二）组成型酶突变株的筛选 1、诱导型酶在生产上的缺点
? 诱导物往往价格昂贵
? 受诱导物种类，浓度及分解产物的影响
2、筛选原理
通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。
3、筛选方法
创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势或者适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。
? 恒化器法
以诱导物作底物，浓度低于起诱导作用浓度，诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长，通过连续不断加入新鲜基质，使变异株数量逐渐增多，最后达到能分离的浓度。
? 循环培养法
不含诱导物培养基 ? 含诱导物培养基
(普通碳源或氮源） （诱导物作唯一碳源或氮源）
（三）细胞膜透性突变型 1、提高细胞膜透性的优点
? 使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量
? 使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物
2、提高细胞膜透性 的措施
第四节 基因重组 遗传重组的一般概念
? 遗传重组（基因重组）：遗传重组是指遗传物质从一个细胞向另一个细胞传递并导致DNA交
换和重排的过程。
?遗传改造的手段包括基因突变和基因重组 ? 微生物中基因重组的方式：
? 真核微生物：有性生殖和准性生殖； ? 原核微生物：接合、转化、转导
一、细菌的转化
定义：受体细胞直接吸收裸露的外源DNA并与其自身遗传物质发生重组，从而使受体细胞获得共体细胞部分遗传性状的现象。 1、转化过程
? 感受态受体细胞
? 转化因子的吸附和吸收
? 转化因子的整合及转化子的形成
二、 转导 Transduction
通过噬菌体作为媒介，而把一个细菌的基因导入另一个细菌的过程叫转导。 转导的组分：
供体细菌，受体细菌，转导噬菌体
（一）局限性转导specialized transduction
只能传递供体染色体上原噬菌体整合位点附近的少数固定基因的转导。 1、转导噬菌体的形成
? Campbell模型（不正确切离） ? 形成频率：10-6
2、转导子的形成
? 稳定转导子的获得——双交换 ? 不稳定转导子的获得——溶原化
微生物学章节总结笔记第六章
