第一章 绪 论
1.基因工程的基本流程？
1、从生物体中分离得到目的基因（或DNA片段）
2、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA分子。 3、将重组DNA分子导入受体细胞中，并进行繁殖。
4、选择得到含有重组DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增。
5、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。
2.基因工程诞生的标志是什么？
理论上的三大发现和技术上的三大发明标志着基因工程的诞生
(1)理论上的三大发现：利用肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质；Watson 和Crick提出DNA双螺旋结构模型及半保留复制机制； 提出“中心法则”和“操纵子学说”。
(2) 技术上的三大发明：工具酶的发现和应用；载体的发现及应用；利用CaCl2法将重组子导入受体细胞。 3.基因工程有哪些主要应用？
(1)在医药领域：重组药物，基因治疗，检测遗传疾病、病原。等
(2)在农业领域：提高农作物品质、抗病虫性、抗逆性等；提高花卉的观赏价；值控制家畜瘦肉比、饲料利用率，加快畜禽生长。
(3)在工业领域：啤酒酿造；白酒和黄酒的酿造和酒精生产；干酪；“吃油”工程菌；纤维素酶等。
第二章 基因工程的载体和工具酶
1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ ⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ ①自主复制性 ②可扩增性 ③可转移性 ④不相容性
F质粒、R质粒、Col 质粒、降解质粒、致瘤质粒 3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？ 插入型：克隆能力小，不到10kb 置换型：克隆能力大，20～25kb
6. 限制性内切核酸酶的特点有哪些？ 1、识别位点的特异性 2、识别序列的对称性 3、切割位点的规范性
8. DNA聚合酶和 Klenow大片段各有什么作用？ DNA聚合酶
A.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针：利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B.用于DNA连接前的大缺口填充：利用5′--3′的聚合酶活性。 C.用于DNA的序列分析：利用5′--3′的聚合酶活性。 Klenow片段
⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端
⑵标记DNA片段的末端：底物用［α－32P］－dNTPs ⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成 ⑷DNA序列的测定
9.三种特殊的粘性末端的连接 ：
1）加上DNA接头：平端加上一个人工合成的、短的、平末端的双链DNA片段，但包含有新的酶切位点，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。 2）加上寡核苷酸接头：平端加上人工合成的、寡核苷酸，但该寡核苷酸本身具有一个粘性末端和一个平端。 3）同聚物加尾连接：由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，如：poly(dG)/ poly(dC) ，制造出粘性末端再连接。
10. 碱性磷酸酶有什么作用？
⑴在用32P标记DNA 5′端之前，去除5′端的磷；
⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。 11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？
给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。
13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？ ⑴DNA的纯度
⑵DNA的甲基化程度
⑶酶切反应的温度（通常为37℃ ） ⑷DNA的分子结构
⑸核酸内切限制酶的缓冲液
第三章 基因工程的常规技术
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么
在电场的作用下，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？
除样品DNA本身的大小外，琼脂糖凝胶电泳的分辨能力与胶的浓度、缓冲液、电压等有很大关系。 3.凝胶制备的注意事项：
1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜）。
2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长。 3、EB含量要适当。
4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化。 5、检查梳子。
6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度。 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出。
4.琼脂糖凝胶电泳的基本过程：制胶→放入电泳槽中并加入电泳缓冲液→取出梳子→将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 →定电压条件下电泳→合适的时间后停止电泳→取出凝胶进行溴化乙锭染色→凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果。
5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 DNA→琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色 Southern杂交主要用于检测DNA
6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。
mRNA提取→甲醛变性电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或化学发光 Nouthern杂交主要用于检测RNA
7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？ 用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应。
SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）→封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应→ 洗涤→显色或化学发光显影
Westhern杂交主要用于检测蛋白质
8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理？
菌落（嗜菌斑）原位杂交也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。 9.探针标记有哪些方法？
（1）切口平移法 （2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法。 10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？
PCR反应体系的主要成分：待扩增的模板、引物、DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。一般设定反应参数94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
15. 什么是荧光定量 PCR？
是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程结合相应软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。 16. 什么是基因芯片技术？
基因芯片技术是指将大量寡核苷酸或DNA探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形
成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。 17. DNA芯片有哪些主要的应用？
DNA芯片基本应用可分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）与定性分析（主要指对基因表达的研究）。DNA序列测定、突变及多肽性分析、基因表达分析、基因组研究、基因诊断、药物研究与开发等
18. 什么是蛋白质芯片？
蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象。其原理是将各种蛋白质有序的固定于某种介质的载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对于的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质互补的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，检测芯片上各点的荧光强度，在通过计算机分析蛋白质之间的相互关系以及基因表达功能等。 19.基因组文库的构建方法是怎样的？ 1.分离基因组 DNA
2.DNA 的断裂：物理剪切 (包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解 3.DNA 片断的分离与连接 4.包装，转染或者转化
20. cDNA文库的构建流程是什么？ 1、mRNA 分离、纯化和分级分离 2、cDNA的合成 3、与载体的连接 4、转化
22. 合成 cDNA第二条链有哪些方法？
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基 缺失 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域和转录激活结构域。这两个结构域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 24. 酵母双杂交系统有哪些应用？
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响 4、鉴定不同突变子与靶蛋白的反应能力。 5、筛选特异克隆。
25. Sanger双脱氧链终止法 DNA测序的基本原理是什么？ 在用DNA聚合酶复制核苷酸链时，如果在反应物中加入一定量的某一种2’，3’-双脱氧核苷酸, 如ddTTP，就会在应当掺入dT的位置掺入ddT。由于ddT核苷酸的3’碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的5’碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键，所以DNA链就不能继续向后延伸。 26. Maxam-Gilbert化学修饰法测序的基本原理是什么？ 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。 27. DNA自动测序的基本原理是什么？
用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5’-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来。 29. 试述 DNA切口平移标记探针的原理。
用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链的有限位置上打开切口。
利用DNA聚合酶I的5’ →3’的核酸外切酶活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。
以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I的5’ →3’的DNA聚合功能把一个一个带有标记的dNTP合成上去。
第四章 基因在大肠杆菌、酵母的高效表达
1.最佳的基因表达体系应具备哪些特点？ ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高;
⑷表达产物容易分离纯化。
2. 基于 T7噬菌体 RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统的主要优点是什么？
T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。
3. 蛋白质的融合表达的原理是什么？
将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白序列的3’末端。表达出来的融合蛋白的N末端含有由载体序列编码的片段。
6. 蛋白质分泌表达的优点有哪些？
1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。 2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。
3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。
4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。 7. 蛋白质的包含体形式表达的概念。
包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。 8. 蛋白质包含体表达的优点有哪些？
不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。 9. 蛋白质包含体复性的方法有哪些特点？ 1.活性蛋白质的回收率高。
2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。 3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。 4.折叠复性方法利用放大。 5.复性过程耗时较少。
11. 酵母表达系统有哪些优点？
优点：全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统；酵母菌是最简单的真核模式生物。
第五章 植物基因工程
2植物转基因技术的基本路线是什么？ 1.目的基因的分离 2.载体构建
3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.对植物组织或细胞进行转化 5.植株再生
6.转基因植株的鉴定 7.转基因植株的种植
3植物转基因的受体系统有哪些？ 1．植物组织受体系统 2．原生质体受体系统 3．生殖细胞受体系统 4.叶绿体转化系统优点
（1）便于外源基因定位整合 （2）基因为多拷贝，表达量高 （3）导入的外源基因性状稳定性高 （4）能直接表达原核基因
4外源基因导入植物的方法有哪些？ （一）DNA直接转移法 1.化学刺激法 2.电击法
3.显微注射法 4.基因枪法 5.脂质体介导法 6.微激光束法 7.花粉管通道法
（二）农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 5简述Ti质粒的结构特点。
Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。
T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的
农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。 6请阐述Ti质粒介导植物基因转移的过程。
植物愈伤组织的诱导→农杆菌的活化→愈伤组织与农杆菌的共培养→抗性愈伤组织获得及植株再生 8提高外源基因在植物体内表达水平的策略有哪些？ 1.改进转化方法
2.选择强启动子和诱导型启动子 3.强终止子
4. 使用植物偏爱的密码子 5.使用基质结合区序列 6.使用增强子
7.外源基因的修饰与改造
18什么是基因沉默，导致转基因发生失活的原因有哪些？
由于重复序列之间发生自发配对，形成可被甲基化酶特异性识别的结构而发生甲基化作用，从而抑制基因表达。外源基因如果以多拷贝的形式整合到染色体DNA的同一位点上，就会形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，不能进行转录，并且拷贝数越多，基因沉默现象也就越严重。此外，重复序列间的相互配对也可以导致自身的异染色体化，抑制基因表达。 19转基因植物作为生物反应器的优势在哪里？
转基因植物作为一种新型的生物反应器，可以生产过去只能从稀有植物乃至其它生物体才能获得的，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质。如激素、抗体、疫苗、营养蛋白、酶、生长因子、药物及保健品等。
20谈谈你对转基因植物的安全性的认识。 1.环境安全 （1）生存竞争
（2）生殖隔离距离
（3）与近源野生种的可交配性 （4）对非靶生物的影响
（5）病毒发生变异重组或异源包装的可能性 2.转基因植物食品安全性及对人健康的影响
第六章 动物基因工程
1. 什么是转基因动物？
动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。 2. 显微注射法制备转基因动物的主要过程是什么？
超数排卵→基因制备→胚胎移植→显微注射→转基因个体的鉴定 3. 逆转录病毒法制备转基因动物的主要过程又是怎样的？
反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。 4. 胚胎干细胞的概念。
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。 7. 什么是动物器官生物反应器？
转基因动物的出现引导人们试图把转基因动物作为一种生物反映器，生产人类所需的医用珍贵稀有蛋白，特别是医用活性肽。
8. 转基因动物有哪些应用？ 1.提高动物的生产性能 （1）改良畜禽生产性状 （2）提高畜禽抗病力 2. 动物生物反应器 3. 异种器官移植 4. 基础研究
10．转基因小鼠的鉴定方法有哪些？ 标记筛选法
（1）正负选择标记筛选法 （2）无启动子筛选法 分子鉴定法 （1）PCR扩增 （2）斑点杂交
（3）Southern杂交 （4）荧光原位杂交
基因工程复习题
