细胞生物学技术

第二章 第三章 第四章 电镜

1. 电镜、分辨率、透射电子、二次电子、电子束、超薄切片、免疫电镜技术

电镜：以电电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子散射产生的信号进行显微成像的具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构

分辨率：用于表示人眼和光学仪器能够辨别的两点之间最小距离的标志。人0.2mm，光镜0.2um。分辨率是衡量电镜性能的重要指标。

透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子。（利用透射电子信息成像的称为透射电镜）

二次电子：在入射电子的轰击下,样品表面5-50 nm 深度激发出来的电子称为二次电子。（利用二次电子信息成像的称为扫描电镜）

电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性。电镜利用电子束作为“光源”成像。

超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。

immune electron microscopy：免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。

2. 电镜在医学领域的应用

观察细胞器和组织器官的超微结构；观察病毒和细菌等；观察组织细胞超微病理结构；用于临床疾病的诊断；观察生物材料复合体及模式生物等

3. 从分辨率、放大倍率、成像信号、样品制备、图像特点和应用几方面对透射电镜和扫描电镜进行比较

TEM分辨率为0.1nm，放大倍率是100万倍，成像信号为透射电子信号成像，样品制备过程复杂，要制成50～100nm的超薄切片，图像特点为二维结构，平面图像， TEM用于观察组织细胞内部的超微结构。

SEM分辨率为 0.6nm，放大倍率是80万倍，成像信号为二次电子信号成像，样品制备方法较简单，标本可大而厚，图像特点为三维结构图像，立体感较强， SEM 用于观察样品表面及其断面立体形貌。

4. 了解细胞内部的超微结构变化应选择哪种类型的电镜，为了保证良好的超微构，在样本取材及固定时应注意什么？如果是培养细胞，细胞数量一定要达到多少？ 了解细胞内部的超微结构变化应选择TEM。

为保证良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。快：在1分钟内固定组织，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。小：组织块必须切成1mm3的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。轻：不要牵拉、锯、挤压组织。要用锐利的刀片，避免细胞受到损伤。冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。

如果是培养细胞，细胞数量一定要达到1×107

5. 在透射电镜样本取材时，样本不可大于1mm3，并在1分钟以内完成固定。请问如果组织块过大会出现什么后果？没有及时固定的组织电镜下会出现何种改变？

由于电镜固定液戊二醛对组织的穿透能力较弱，如果组织块过大会造成组织中心得不到及时固定，在电镜下没有得到及时固定组织细胞的细胞器会发生变性，特别是对缺血乏氧十分敏感的线粒体会出现肿胀和空泡变性等改变。

6. 扫描电镜用于观察组织表面结构，因此取材时必需要充分暴露组织表面结构，请问常用的方法和注意事项有哪些？

在样品取材时必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤要观察的部位，易卷曲的样品, 如气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净。

7. 什么是血管灌注固定？为什么脑、心、肾脏等组织要进行灌注固定取材？在样品制备过程中为什么要进行半薄切片定位？

血管灌注固定是通过血管灌注适量的固定剂，在动物体内把活细胞在原位及时固定。血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响，特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要。

半薄切片的意义在于：1 选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片来选取有意义的部位。2 对同一部位进行光、电镜对比观察，在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。

第六章 第八章

1. 免疫细胞化学技术间接法的优点有哪些

1 只要拥有同一种属的一抗和标记的二抗就可以操作而不必对针对各种抗原的一抗做标

记，大大简化了抗体的制备

2 一个一抗分子可以和多个二抗分子结合，提高了灵敏度 3 一抗未经标记，可以避免标记造成的对抗体抗原结合的影响

2. 免疫荧光双标技术

双标用两种荧光素分别显示不同的抗原物质，使几种待测物质可以由不同颜色的荧光素在同一张组织切片上反映出来，效果非常直观。双标要求一抗种属分开，二抗颜色分开。

3 名解ABC，LSAB，探针

ABC：亲和素生物素酶复合物技术，把亲和素与生物素偶联的过氧化物酶或碱性磷酸酶按照一定比例组合成亲和素－生物素－酶复合物，能保证其中的亲和素有一定的游离结合位点让生物素偶联物质结合。

LSAB：生物素标记的链球菌亲和素，具有灵敏度高。特异性强，稳定性好的优点。此法实验过程中有一下几点注意事项：封闭、使用双氧水、显色。

探针：指一些序列已知或序列未知但分子已知的核酸分子。后者指的是虽不明确该分子全部序列但已知其针对何靶分子。探针主要分为ｃＤＮＡ，ＲＮＡ和寡核苷酸三种。

４．亲和技术原理

利用两物质之间亲和能力而互相结合，以定位特异分子的技术，最常用的亲和物质系统是亲和素和生物素。

５．原位杂交的应用

原理：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

应用：

６．为什么原位杂交技术是分子细胞生物学水平技术？（原位杂交技术中如何应用了其他几种细胞化学技术？）

第九章 流式细胞分析术

1. 名解：流式细胞分析术，荧光补偿；DNA指数，增殖指数;收获率和纯度

FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。（层流技术保证了样品中的每一个细胞都沿流动室中心轴运动，实现了每一个细胞以相同的速度、相同方向、相同的轨迹流经仪器检测区。）

荧光补偿：目前使用的荧光素都是宽发射谱的，相互之间有明显重叠部分。分束片和滤色片等光学元件不能完全解决这些问题。实际工作中常用的方法是利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻萤光通道的信号加以扣除。即荧光补偿。

DNA指数：DI，用于描述样品细胞DNA含量的偏离程度和倍体水平。定义为整成二倍体细胞的DI=1.0 ，而被测样品的DI为 （被测样品中G0/G1细胞DNA含量）/正常二倍体DNA含量。

增殖指数：PI，用来反映肿瘤细胞的增殖能力。定义为样品细胞群体中S期细胞G2M细胞之和占总细胞群体的百分比。

收获率：指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。 纯度：指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。

2. FCM细胞散色光信号和荧光信号

FCM被测样品中的细胞流经了仪器检测区时受到激发光的照射，激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。

散射光信号分为前向角散射信号和侧向角散射信号。前与细胞大小有关，侧包含有细胞内部结构形态学信息。

荧光信号主要指经过特异萤光染色后细胞受照发射的荧光信号。（掌握荧光的特异性以及定量关系）

3. FCM的数据储存方式、FCM的不同显示方式

FCM数据储存方式为List Mode。显示方式分为单参数（直方图），双参数（散点图、等高线轮廓图和假三维图）和多参数数据显示。

直方图：横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。

散点图：在二维图上，X轴代表第一个测量参数，Y轴代表第二个测量参数。每个点代表一个细胞。

等高线：用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。

假三维：纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。 多参数数据显示图：三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。

4. 比较单细胞悬液的制备过程中分散细胞的方法 常用方法有酶消化法、机械法和化学试剂处理法。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。可以用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。

总之FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。

5. 酶消化法应注意哪些条件?

配制酶溶液试剂时要兼顾酶反应的适宜条件与活细胞要求的生理环境；注意酶溶液的适用浓度；注意酶消化过程的最佳温度与持续时间

6. 读图：线性分布直方图、多参数数据显示方法P115、P118