烟草花叶病毒的检测方法研究进展
摘要 烟草花叶病毒（tmv）的寄主范围相当广泛，给农业生产带来重大损失，加强对该病毒的检测具有重要意义。在查阅近年来国内外文献的基础上，总结了对烟草花叶病毒的检测方法如直接观测法、电子显微镜检测法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等的研究进展。随着植物种质资源的引进和生态条件的改变，对检测tmv方法提出了更高的要求，因此在实际应用中要综合运用各种检测方法提高检测的准确性。 关键词 烟草花叶病毒；检测方法；研究进展
中图分类号 s188；s435.72 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）11-0128-02
烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，tmv）是一种rna病毒，病毒粒体为棒状，长度为300～310 nm、直径18 nm；病毒基因组为单分子线形正义ssrna，长6 300～6 600 nt；衣壳蛋白由一种多肽组成，分子质量为17～18 kda。tmv的寄主范围非常广，可侵染的植物达150多个属，主要是一些草本双子叶植物，包括蔬菜、花卉和烟草等，导致烟草和番茄等作物的严重危害[1]。烟草业在我国经济中占据着重要的地位，而烟草花叶病严重危害烟叶的产量和质量，成为优质烟叶生产的因子，是烟叶出口所面临的挑战，同时给我国造成巨大的经济损失。不同条件下同种病毒的症表现状有很大差异，而不同病毒在烟叶上表现为相似的症状，烟草花叶病毒检测对于烟叶病毒的防治提供理论依据，同时也对进一步识别病毒
病害和防止病毒传播危害具有重要的实际意义。 1 直接观测法
直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状。烟草花叶病毒属中大多数病毒的寄主范围较广，对外界环境的抵抗力强，自然传播不需要介体生物，靠植株间的接触（或有时种子）传播。如在烟草上自苗期至大田期可连续发生，早期发病烟株节间缩短、植株矮化、生长缓慢，幼苗被侵染后，新叶的叶脉颜色变浅，而后形成黄绿相间的花叶症；苗期侵染的植株发育缓慢。大田期植株发病，除显示明脉、花叶症状以外，病叶上会形成疱斑，厚薄不匀；叶片出现各种畸形。其缺点是寄主植物出现症状需时较长，取得鉴定结果较慢，且有的病毒并不使寄主表现症状，无法检测[2]。 2 电子显微镜检测法
显微镜长期以来是研究细胞、病毒及生物大分子的形态及结构的重要工具。烟草花叶病毒形态为直杆状，呈现为长300 nm、直径18 nm的圆柱形结构，其中心含有1个约4 nm的沟槽。该病毒蛋白外壳围绕1个约6 400个核苷酸的单股rna形成。围绕单股rna的蛋白亚基具有螺旋形结构，其螺距为2.3 nm。将感病材料制成超薄切片，在电子显微镜下直接观察。取5 μl溶解在20 mmol/l磷酸缓冲液（ph值7.0）中的烟草花叶病毒（0.2 mg/ml），将其滴加在新鲜剥离的云母表面上，然后用0.5%的磷钨酸染色。所得样品用afm可以清楚地观察到棒状的tmv拓扑结构。 3 生物学测定法
用人工摩擦接种法把待测病株汁液接种于一些指示植物叶片上，一段时间后在接种植物上会表现出花叶、褪绿点、枯斑等症状，以此断定病毒的存在。病毒在指示植物症状表现受温度影响，故需掌握好季节进行观察记载。 4 血清学检测法
酶联免疫吸附法（elisa）是目前最常用的血清学方法之一。目前，在生产上检测pvy 的方法主要有硝酸纤维素膜- 酶联免疫法（ncm-elisa）、三抗体夹心酶联免疫吸附法（tas-elisa）、双抗体夹心酶联免疫吸附法（das-elisa）等。
4.1 a蛋白夹心-elisa和双克隆抗体夹心elisa
das-elisa是用另一病毒抗体与抗原识别抗原。肉眼可见橘黄色为阳性，仪器测定490 nm od值，其中样品od值/阴性对照od值 >2为阳性[3]。检测的样品为阳性，再接种鉴别寄主。吴 峰等[4]应用单克隆抗体技术获得抗烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，tmv）单克隆抗体，并通过胶体金标记技术，免疫层析快速检测技术和squid 磁学定量测定技术建立起烟草花叶病毒的快速检测方法，并开发出用于定性检测的tmv胶体金快速检测试纸及用于定量检测的tmv纳米磁珠快速检测试纸，其检测灵敏度分别为1 ng/ml和0.1 ng/ml，所建立的方法操作简单，快速，灵敏度高，特异性好，是作为烟草育苗中各种tmv无症和有症烟株现场筛查的有效手段[4]。
4.2 胶体金免疫层析法
该方法为采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记烟草环斑病毒（trsv）的抗体，制成免疫检测试纸条。通过对马铃薯病毒x（pxv）、马铃薯病毒y（pyv）坏死株、黄瓜花叶病毒（cmv）等9种病毒进行测试，未出现非特异性反应，而用烟草环斑病毒（trsv）测试呈阳性反应。
4.3 免疫电镜（sem）技术
血清学与电镜相结合的检测技术，已广泛应用于植物病毒如黄瓜花叶病毒（cmv）、烟草环斑病毒（trsv）检测。陈建平[5]建立了胶体金免疫电镜技术，用于快速检测和鉴定病汁液中棒状病毒、球状病毒、线状病毒。 4.4 伏安酶联免疫分析法
该法是用联苯胺-hzoz一辣根过氧化物酶（hrp）测定烟草花叶病毒（tmv）和烟草环斑病毒（trsv）。根据igg-hrp与植物病毒及其抗血清的免疫反应，可以间接测定植物病毒。封立平等[6]将酶联免疫吸附技术同电化学检测相结合的电化学酶联免疫分析法已成功应用于植物病毒的测定。 5 分子生物学方法
分子生物学检测方法将病毒检测灵敏度由血清学的ng水平提高到了pg级[7-8]。 5.1 rt-pcr检测技术
根据已知的病毒特异基因序列，设计合成引物；以病毒rna为模板，反转录合成cdna第1条链；取一定量的反转录产物，加入过
量引物、pcr反应缓冲液、dntp、taq dna聚合酶，在pcr仪上扩增；采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果[9-10]。张俊祺等[11]根据黄瓜花叶病毒基因组序列相对保守区域设计了1对特异性引物，整合了反转录和pcr反应所需酶和缓冲液，通过反应条件的优化，建立了基于一步法rt-pcr 检测烟叶感染cmv的方法，在此基础上组装了检测试剂盒。进一步分析了该试剂盒的特异性、稳定性和检测灵敏度。结果表明，该试剂盒具有很强的特异性、良好的重复性和较高的灵敏度（模板rna浓度最低达到10 ng量级）。初步应用结果显示，在多个烟区采集的病叶样品检测结果均与elisa检测结果一致，能够成功检测出cmv。 5.2 核酸杂交检测技术
核酸杂交检测技术（nash）是将一段病毒核酸单链以某种方式加以标记，制成探针，再与互补的待测样品核酸杂交，通过带有探针的杂交核酸来指示病原[12]。刘凌凤等[13]用新型荧光探针-分子信标进行植物病毒检测的方法，可以不对病毒rna 进行严格分离和纯化，就能得到检测结果。此方法被用于烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，tmv）基因组rna 的检测，为植物病毒分子生物学的研究提供了新的手段[14]。 5.3 基因芯片技术
基因芯片技术是将无数预先设计好的寡核苷酸、cdna、基因组（genomic）dna在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交，对样品的序列信息进行高效的解读和分析[15-17]。贾 慧等[18]试
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