测定蛋白酶活力实验
一、实验目的 1.加深了解
酶活力的概念。
2.学习掌握
测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理 酶活力
指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力
单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯
草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通
过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试
剂
仪器:
恒温水浴锅、
分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料 枯草杆菌蛋
白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂 1. Folin-酚
试剂：
在2L 磨口
回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L
盐酸溶液
3. L 氢氧化
钠溶液
4. L 碳酸钠
溶液
5. 10%三氯
乙酸溶液
6. 磷酸缓冲
液：
称取磷酸氢
二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。
7. 标准酪氨
酸溶液(50μg/mL)：称取 以烘干至恒重的酪氨酸，用L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。
8. 酪蛋白溶
液%)：称取1.25g 酪蛋白，用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用磷酸缓冲液定容到250mL。
四、操作步骤 (一)酪氨酸
标准曲线的制作
取6支试管
(标号0，1~5)，按顺序分别加入，，，，和 标准酪氨酸溶液，再用水
测定蛋白酶活力实验
