高糖诱导内质网应激对血管内皮细胞炎症反应的作用
丘雅维1，陈燕铭1，吕秋菊1，李晓峰2，江 玮1，曾龙驿1*
【摘 要】【目的】探讨高糖通过诱导内质网应激（ERS）引起人脐静脉内皮细胞（EAhy926）炎症反应的作用机制。【方法】人脐静脉内皮细胞给予正常浓度糖（5.5 mmol/L）或高浓度糖（25 mmol/L）干预 0、2、4、8、12 h，或 ERS 诱导剂毒胡萝卜素（TG）0.5 μmol/L 干预 24 h。 Western blot检测下列蛋白表达水平：细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）等炎症因子；葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（p-eIF2α）、活化转录因子4（ATF4）等ERS标志蛋白；以及磷酸化信息传递与转录活化因子3（p-STAT3）和总信息传递与转录活化因子3（t-STAT3）。【结果】炎症因子ICAM-1、TNFα，ERS标志蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF4以及p-STAT3等蛋白的表达均随高糖干预时间的延长而逐步增加，除GRP78在干预8 h后达到峰值（P ＜ 0.05），其余蛋白均在干预 12 h 后达到峰值（P ＜ 0.05）。 给予 ERS 诱导剂 TG 干预细胞 24 h，GRP78、p-eIF2α、ICAM-1、TNFα 的表达水平均明显增加，分别是对照组的 5.55 倍、1.63 倍、1.76 倍、2.07 倍（P ＜ 0.05）；此外，p-STAT3 的表达水平也有所增加，为对照组的 2.15倍（P＜0.05），但 t-STAT3水平无明显变化（P＞0.05）。 【结论】高糖可诱导内皮细胞发生 ERS与炎症反应，ERS诱导剂可诱发细胞的炎症反应，磷酸化的STAT3信号途径可能起到连接ERS与炎症反应的重要作用。 【期刊名称】中山大学学报（医学科学版） 【年(卷),期】2013(034)001 【总页数】6
【关键词】内质网应激；炎症反应；人脐静脉内皮细胞；信息传递与转录活化因子3
血管内皮细胞作为人体重要的内分泌器官，不仅起屏障作用，还具有调节血管舒缩状态，防止炎性细胞浸润等多种功能。有观点认为血管内皮功能可能早在糖尿病起始阶段即已受损［1］。而近年研究提示糖尿病可能是一种慢性低度炎症性疾病，炎症因子参与糖尿病及其血管并发症如糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发生、发展［2］，但是由高糖直接触发还是通过其他机制间接引起炎症反应，目前尚无定论。本研究拟探讨高糖通过诱导内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）引起人血管内皮细胞炎症反应的作用机制，为DR的防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材 料
人脐静脉内皮细胞株EAhy926由中山大学附属第三医院心内科钱孝贤教授惠赠。主要试剂：RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）购自南京凯基公司；毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）购自美国ENZO公司；D-葡萄糖、甘露醇、细胞裂解液均购自广州捷倍斯公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自美国Pierce公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；兔抗人细胞间黏附因子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）单抗、兔抗人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）单抗、兔抗人葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）单抗、兔抗人磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（phosphorylated eukaryotic translation
initiation factor-2α，p-eIF2α） 多抗、 兔抗人总 eIF2α（total eIF2α，t-eIF2α）多抗、兔抗人磷酸化信息传递与转录活化因子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）多抗、兔抗人总STAT3（total STAT 3，t-STAT3）单抗、兔抗人 β-actin单抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗人活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）单抗购自英国Abcam公司；荧光标记的羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗均购自美国Odyssey公司。 1.2 细胞株培养
EAhy926细胞常规培养于含体积分数100 ml/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于体积百分比为5%CO2的37℃培养箱中，隔天换液1次，待细胞长至70%～80%融合后，换上无血清RPMI 1640培养基过夜孵育细胞，使细胞生长同步化，然后将细胞按实验设计分组。 1.3 实验分组
正常糖组（NC，5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（HG，25 mmol/L D-葡萄糖）、 渗透压对照组（Mannitol，NC+19.5 mmol/L 甘露醇）、毒胡萝卜素组（TG，NC+0.5 μmol/L 毒胡萝卜素）。 1.4 Western blot检测蛋白表达
各组细胞用细胞裂解液裂解后4℃（16 000×g）离心15 min取上清液即可得总蛋白，BCA法测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）约2 h，用电转移法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉或5%BSA室温封闭2 h，加入一抗［兔抗人ICAM-1单抗、兔抗人TNFα单抗、兔抗人GRP78单抗、兔抗人p-eIF2α多抗、兔抗人t-eIF2α多抗、兔抗人 p-STAT3多抗、鼠抗人
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