___________基于SRAP分子标记的贵州5种忍冬属药用植物遗传多样性分析<p><br/></p>

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2024，49（12）：2349-235512期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·2349·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2024.12.01基于SRAP分子标记的贵州5种忍冬属

药用植物遗传多样性分析

潘绿昌1，赵

致1*，何

云2，李园园1，刘红昌1，俸婷婷2，周

技术研究中心，贵阳

550025）

英2

（1贵州大学农学院/贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵阳550025；2贵州省药食同源植物资源开发工程

摘要：【目的】分析贵州5种忍冬属药用植物的遗传多样性，为忍冬属药用植物鉴定、良种筛选及开发利用提供理论依据。【方法】采集贵州6份忍冬属药用植物材料的嫩芽为试验材料，采用SRAP分子标记研究其遗传多样性，并利用NTSYS-pc2.1计算各材料间的遗传相似系数，利用UPGMA进行聚类分析。【结果】从154对SRAP引物组合中筛选出15对重复性好、条带清晰、多态性丰富，且扩增条带（100~1000bp）数目≥5的引物组合。15对SRAP引物共扩增出197条带，其中178条为多态性条带，多态性条带比率为90.36%，平均每对引物扩增11.87条多态性条带。引物组合Me8-Em10扩增的多态性条带数最多（16条）；引物组合Me2-Em2扩增的多态性条带最少（8条）；引物组合Me4-Em2扩增条带数为15条，均为多态性条带，但从5种忍冬属药用植物的扩增条带数不同。聚类分析结果显示，6份忍冬属药用植物材料间遗传相似系数为0.4213~0.8477，平均0.5672；其中，野生忍冬与栽培忍冬间遗传相似系数最大（0.8477），二者亲缘关系最近，灰毡毛忍冬与野生忍冬遗传相似系数最小（0.4213），二者亲缘关系最远。在遗传相似系数0.4873处，6份忍冬属药用植物分为两大类，第Ⅰ类包括灰毡毛忍冬、红腺忍冬和黄褐毛忍冬，均为山银花的基源植物；第Ⅱ类包括野生忍冬、栽培忍冬和红白忍冬，均为金银花的基源植物。【结论】贵州5种忍冬属药用植物具有丰富的遗传多样性，SRAP分子标记能有效分析其遗传多样性及亲缘关系，其引物组合Me4-Em2可用于鉴别5种忍冬属药用植物。

关键词：忍冬属药用植物；SRAP分子标记；遗传多样性；遗传相似系数；聚类分析中图分类号：S567.790.24文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）12-2349-07

Geneticdiversityamongfivespeciesmedicinalplantsof

LoniceraL.inGuizhouProvincebySRAPmolecular

markersanalysis

PANLü-chang1，ZHAOZhi1*，HEYun2，LIYuan-yuan1，LIUHong-chang1，

FENGTing-ting2，ZHOUYing2

（1CollegeofAgriculture，GuizhouUniversity/GuizhouKeyLaboratoryforPropagationandCultivationofMedicinal2

Plants，Guiyang550025，China；GuizhouTraditionalChineseMedicineandEthnicDrugEngineeringCenter，

Guiyang550025，China）Abstract：【Objective】AnalysisofgeneticdiversityoffivespeciesmedicinalplantsofLoniceraL.inGuizhouProvin-cewasconducted.Itprovidedreferencefortheidentification，finebreedselectionandutilizationofmedicinalplantsof

LoniceraL.【Method】CollectingthetendershootsofsixmedicinalplantssamplesofLoniceraL.astestmaterialsinGui-zhouProvince，theirgeneticdiversitywasstudiedbySRAPmarker，andthegeneticsimilaritycoefficientamongthemate-rialswascalculatedbyNTSYS-pc2.1.TheUPGMAmethodwasusedforclusteranalysis.【Result】Fromthe154pairsofSRAPprimercombinations，15pairsofprimercombinationswithgoodreproducibility，clearbandsandrichpolymor-phism，andamplifiedbands（100-1000bp）≥5werescreened.Atotalof197bandswereamplifiedby15pairsofSRAPprimers，amongthemtherewere178polymorphicbands.Thepercentageofpolymorphicbandswas90.36%.Onaverage，eachpairofprimersamplified11.87polymorphicbands.Amongthem，theprimercombinationofMe8-Em10amplifiedthemostpolymorphicbands（16），buttheprimercombinationofMe2-Em2amplifiedtheleastpolymorphicbands（8）.Thenumberofamplifiedbandsofprimer-combinedMe4-Em2was15andallwerepolymorphicbands，thenumberofam-plifiedbandsoffivemedicinalplantssamplesofLoniceraL.wasdifferent.Clusteranalysisresultsdisplayed，thesimilaritycoefficientbetweenthesixmedicinalplantssamplesofLoniceraL.was0.4213-0.8477，andtheaveragesimilaritycoeffi-cientwas0.5672.Amongthem，thegeneticsimilaritycoefficientbetweenwildL.japonicaThunb.andcultivatedL.japonica收稿日期：2024-10-14基金项目：贵州省社会攻关计划项目（黔科合〔2016〕支撑2909）；贵州省药用植物繁育与种植人才基地项目（黔人领发〔2013〕15）；

贵州省生物学一流学科建设项目（GNYL〔2017〕009）

作者简介：*为通讯作者，赵致（1959-），教授，博士生导师，主要从事药用植物生产理论与实践研究工作，E-mail：zzhao@gzu.edu.cn。

潘绿昌（1993-），研究方向为作物栽培学与耕作学，E-mail：1085656396@qq.com

·2350·南方农业学报49卷Thunb.wasthehighest（0.8477），indicatingthatthegeneticrelationshipwastheclosest，andthegeneticsimilaritycoeffi-cientofL.macranthoidesHand.-Mazz.andwildL.japonicaThunb.wasthesmallest（0.4213），indicatingthatthegenetic

relationshipwasthefarthest.Atthegeneticsimilaritycoefficientof0.4873，sixmedicinalplantssamplesofLoniceraL.weredividedintotwocategories.ThefirstcategoryincludedL.macranthoidesHand.-Mazz.，L.hypoglaucaMiq.andL.fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng，allofwhichwerethebaseplantsoftheFlosLonicerae.ThesecondcategoryincludedwildL.japonicaThunb.cultivatedL.japonicaThunb.andL.japonica.var.chinensis（Wats.）Bak.，whichwerethebaseplantsofLoniceraejaponica.【Conclusion】ThefivespeciesmedicinalplantsofLoniceraL.haverichgeneticdiversityinGuizhouProvince.SRAPmolecularmarkerscaneffectivelyanalyzetheirgeneticdiversityandgeneticrelationship.TheSRAPprimercombinationofMe4-Em2canbeusedtoidentifyfivespeciesmedicinalplantsofLoniceraL.

Keywords：medicinalplantsofLoniceraL.；SRAPmolecularmarker；geneticdiversity；geneticsimilaritycoeffi-cient；clusteranalysis

0引言

【研究意义】忍冬（LonicerajaponicaThunb.）、灰毡毛忍冬（L.macranthoidesHand.-Mazz.）、红腺忍冬（L.hypoglaucaMiq.）、华南忍冬（L.confusaDC.）和黄褐毛忍冬（L.fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng）均被作为大宗药材金银花广泛使用。2005版《中华人民共和国药典》首次将传统金银花分为金银花和山银花两类，并规定金银花的来源是忍冬，山银花的来源是灰毡毛忍冬、红腺忍冬和华南忍冬；2010版中华人民共和国药典》又将黄褐毛忍冬纳入山银花类别。忍冬属（LoniceraL.）药用植物品种多样，金银花和山银花药材鱼龙混杂，难辨真假，导致其临床用药存在风险。因此，为了确保金银花和山银花临床用药安全有效，研究这两类药材来源的遗传多样性，并从分子水平对二者进行区分具有重要意义。【前人研究进展】SRAP分子标记具有简单、高效、重复性好、无需预知物种的序列信息等优点，已被广泛应用于药用植物遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传连锁图谱构建、基因连锁标记及基因定位等领域研究（LiandQuiros，2001；曹亮等，2010；王维婷等，2010；柴琨等，2014；潘玉玲，2016）。近年来，为了探索金银花和山银花两类药材的遗传信息差异，较多学者针对二者的遗传多样性进行了研究。杨飞等2007）运用RAPD分子标记对5个金银花品系进行遗传多样性研究，结果发现其多态性条带比列较高，遗传多样性较丰富。王晓明等（2008）利用ISSR分子标记对湖南、山东和河南的22个金银花主栽品种进行遗传多样性分析，结果表明这些品种具有丰富的遗传多样性。陈大霞等（2011）利用SRAP分子标记分析15个不同来源地的野生灰毡毛忍冬及2个花蕾型栽培品种的遗传多样性，结果发现野生灰毡毛忍冬具有丰富的遗传多样性，表明SRAP分子标记可有效分析灰毡毛忍冬的遗传差异。王珊等（2011）采用ISSR和RAPD分子标记对17份灰毡毛忍冬样品进行遗传多样性分析，结果发现两种分子标记均显示其具有较高的遗传多样性，但ISSR分子标记多态性高于RAPD分子标记。李小侠等（2012）采用ISSR和

SRAP分子标记对浙南忍冬属忍冬、灰毡毛忍冬、红

腺忍冬、华南忍冬及黄褐毛忍冬药用植物遗传多样性进行分析，结果表明利用ISSR和SRAP分子标记均可有效分析忍冬属药用植物的遗传多样性。【本研究切入点】贵州忍冬属药用植物栽培历史悠久，黔北的灰毡毛忍冬和黔西南的黄褐毛忍冬栽培历史均达40年（潘绿昌等，2024），但对其遗传多样性研究报道较少，仅赵丹等（2014）采用ISSR和SCoT分子标记对贵州栽培的灰毡毛忍冬遗传多样性进行分析。至今，鲜见有关利用SPAP分子标记分析贵州忍冬属药用植物遗传多样性的文献报道。【拟解决的关键问题】采用SRAP分子标记对贵州5种忍冬属药用植物遗传多样性进行分析评价，为忍冬属药用植物的物种鉴定、良种筛选及开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

供试的5种忍冬属药用植物分别为灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.）、红腺忍冬（L.hypo-glaucaMiq.）、黄褐毛忍冬（L.fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng）、忍冬（L.japonicaThunb.）和红白忍冬L.japonica.var.chinensi（Wats.）Bak.］，其中忍冬又分为野生忍冬和栽培忍冬，材料编号及来源地见表1。以上供试材料均由贵州省药用植物繁育与种植重点实验室提供，并经贵州大学生命科学学院赵财副教授鉴定。主要试剂：琼脂糖购自上海复申生物科技有限公司；金牌Mix（Green）PCR反应试剂购自北京擎科新业生物技术有限公司；DL2000DNAMarker购自贵州弥勒天根生物科技有限公司；40%丙烯酰胺溶液购自生工生物工程（上海）股份有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒（E.Z.N.ATMPlantDNAMiniKit）购自美国OMEGABIO-TEK公司。主要设备仪器：垂直电泳槽（DYCZ-24A，北京六一有限公司）、移液器（Eppendorf，德国）、C1000TMPCR仪（BIO-RAD，美国）、离心机（Thermo，美国）、-80℃超低温冰箱（Thermo，美国）、水平电泳槽（DYCZ-22A，北京六一有限公司）、酶标仪（Thermo，美国）、《（（［12期潘绿昌等：基于SRAP分子标记的贵州5种忍冬属药用植物遗传多样性分析

·2351·制冰机（SANYO，日本）、凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）。

表1供试材料编号及来源地

Table1Samplenumbersandsources

序号材料编号材料名称来源地No.SampleNo.SamplenameSamplesource1HZMRD灰毡毛忍冬贵州省思南县杨家坳乡青年台村2HXRD红腺忍冬贵州省务川县石朝乡乱水村3HHMRD黄褐毛忍冬贵州省安龙县德卧镇大水井村4YSRD忍冬（野生）贵州省安顺市西秀区七眼桥镇兴隆村5ZPRD忍冬（栽培）贵州省赤水市天台镇金坪山村6HBRD红白忍冬贵州省石阡县花桥镇北坪村

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取及纯度检测分别采集6份忍冬属药用植物的嫩芽，于研钵中加入液氮充分研磨至粉状，根据植物基因组DNA提取试剂盒说明

表2SRAP引物序列

Table2SRAPprimerssequence

上游引物ForwardprimerMe1Me2Me3Me4Me5Me6Me7Me8Me9Me10Me11Me21Me22Me23

序列Sequence

5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3'5'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3'5'-TGAGTCCAAACCGGTAA-3'5'-TGAGTCCAAACCGGTCC-3'5'-TGAGTCCAAACCGGTGC-3'5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'5'-TGAGTCCAAACCGGCAT-3'5'-TGAGTCCAAACCGGTCT-3'5'-TGAGTCCAAACCGGGTA-3'5'-TGAGTCCAAACCGGCCC-3'5'-TGAGTCCAAACCGGAAA-3'

提取其DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用全波长酶标仪检测DNA浓度及纯度（OD260/OD280）。最后将DNA稀释为20ng/L，用于后续的PCR扩增。1.2.2引物筛选将14条上游引物和11条下游引物进行组合（表2），共得到154对引物组合。从中筛选出重复性好、条带清晰、多态性丰富，且扩增条带（100~1000bp）数目≥5的引物组合。

1.2.3PCR扩增PCR反应体系25.0μL：PCRMasterMix22.0μL，上、下游引物各1.0μL，20ng/LDNA模板1.0μL。扩增程序参照Li和Quiros（2001）的复性变温法：94℃预变性5min；94℃1min，45℃1min，72℃1min，进行5个循环；94℃1min，50℃1min，72℃1min，进行35循环；72℃延伸10min，4℃保存。

下游引物ReverseprimerEm1Em2Em3Em4Em5Em6Em7Em8Em9Em10Em11序列Sequence

5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3'5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3'5'-GACTGCGTACGAATTAAC-3'5'-GACTGCGTACGAATTGCA-3'5'-GACTGCGTACGAATTCAA-3'5'-GACTGCGTACGAATTCTG-3'5'-GACTGCGTACGAATTCGA-3'5'-GACTGCGTACGAATTCAG-3'5'-GACTGCGTACGAATTCCT-3'

1.2.4扩增产物检测取3.0μLPCR产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压150V，功率4W，时间2.3h。电泳结束后，采用银染法（固定→银染→显色）进行染色，最后用凝胶成像系统观察并拍照。1.3统计分析

根据电泳图谱，从中选取清晰的电泳条带，以“1”或“0”记录相同位置上电泳条带的有或无，转换成0/1矩阵。利用NTSYS-pc2.1计算6份忍冬属药用植物材料间的遗传相似系数（陈大霞等，2011），遗传相似系数（GS）=2N（式中Nij表示在i和j材料ijNi＋N）j，

1-1

1-2

2-1

2-2

3-1

3-2

中共有的条带数量，Ni和Nj分别是i和j材料的条带数量，并按照UPGMA进行聚类分析。

2结果与分析

2.1

DNA提取结果

6份忍冬属药用植物材料各提取2次DNA并进

行凝胶电泳检测，结果如图1所示。条带清晰，无明显杂带，表明提取的DNA质量较好。用全波长酶标仪检测DNA浓度及纯度（OD260/OD280），结果如表3所示。选取各材料DNA浓度最高的溶液用于后续试验。

4-1

4-2

5-1

5-2

6-1

6-2

Fig.1

图16份忍冬属药用植物材料的DNA扩增电泳结果

DNAamplificationelectrophoresisresultsofsixLoniceraL.medicinalplantsamples

1~6：材料编号（与表1对应）；-1和-2分别表示各材料的2个重复

1-6：Samplenumber（correspondingtoTable1）；-1and-2indicatedtworepetitionsofonesample