表8 金标抗体稀释倍数选择结果
稀释倍数 显色情况
2倍 ＋＋＋
3倍 ＋＋＋
4倍 ＋＋＋
5倍 ＋
6倍 －
由表可知，浓缩纯化后的金标抗体作4倍稀释比较合适，单稀释倍数超过4×后，NC膜上斑点颜色较浅或不显色。 6 试纸条组成材料的选择
6.1用于胶体金免疫层析试验的膜多为硝酸纤维素膜（NC膜），对NC膜的选择常有以下要求：
6.1.1蛋白结合力: NC膜与蛋白质结合的机理是静电引力。胶体金免疫层析试验用的NC膜IgG的结合力常为50～200μg/cm2。
6.1.2孔径大小：孔径大小是一个关键因素，免疫层析试验使用的膜孔径多为0.5～1.0μm。
6.1.3层析速率：层析速率可用两种方式表示，单位时间层析流动的距离(cm/min)和单位长度层析流动所需时间(s/4cm)。本试验供筛选的4种NC膜的层析速率见表9：
表9 NC膜的层析速率
膜的类型 AE 98 AE 98 Fast AE 99 AE 100
层析速率(s/4cm)
160～210 110～160 120～160 90～120
厚度(μm) 120 120 120 120
6.1.4膜的厚度：厚度对层析速率影响不大。
6.1.5抗张强度：膜的可拉伸强度和弹性范围，如果膜的抗张强度太低在制备过程中会出现类似于断膜等许多问题。 6.2 硝酸纤维素（NC）膜的选择
6.1.1 用包被抗原在AE98、AE98 Fast、AE99、AE100四种NC膜上分别点样，干燥、封闭后再分别滴加金标抗体溶液，比较不同膜的显色情况。
6.1.2 用AE98、AE98 Fast、AE99、AE100四种NC膜分别组装试纸条，比较不同
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膜的层析速度，比较相同时间内不同膜上检测线的显色情况。
表10 NC膜点样显色结果
NC膜型号 显色情况
AE98 ＋＋＋
AE98 Fast ＋＋＋
AE99 ＋＋＋
AE100 ＋＋＋
由表可知，不同NC膜点样显色颜色都很深，没有明显区别。
6.1.3不同NC膜组装的试纸条试剂展开速度和加样5min后的检测线显色结果见表11。
表11 NC膜层析显色结果
NC膜型号 试剂展开速度（s） 5min后检测线显色情况
AE98 95 ＋＋
AE98 Fast
72 ＋
AE99 85 ＋＋＋
AE100 63 ＋
由表可知，AE98 Fast、AE100试剂展开速度较快，5min内检测线显色较浅，AE98、AE99试剂展开速度较慢，AE99 上检测线显色较AE98上检测线显色深，且背景颜色很浅，四种膜中，AE99更符合试纸条设计要求。 6.2其他材料的选择
金标垫多采用玻璃纤维素等蛋白质吸附性低的纤维素膜。样品垫多采用玻璃纤维或纤维素滤膜，玻璃纤维吸收量小，一般用于测定血液制品，纤维素膜吸收量大，一般用于尿样或大量体液的检测，并可在其中加入一定的封闭剂或增稠剂以优化试验过程。吸收垫多采用具有高吸水能力的纤维素滤膜，通过改变吸收垫的大小可以调整试验结束的时间。背衬板用于支撑NC膜，一般为附有压力敏感胶的聚脂板或塑料板。 6.2.1 结合释放垫的选择
将稀释好的金标抗体滴加在Glass 33、Glass 24、GFC20300，温箱烘干后，组装试纸条，比较不同玻璃纤维素膜上金标抗体的释放情况，比较NC膜上的检测线显色情况。结果见表12。
表12 结合释放垫选择结果
玻璃纤维素膜 金标抗体释放情况
Glass 33 释放完全
Glass 24 少量残余
GFC20300 少量残余
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检测线显色情况 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋
由表可知，Glass 24组装的试纸条上检测线较Glass 33组装的试纸条上检测线颜色浅，检测完成后Glass 24上有少量的金标抗体残余。故选择Glass 33作为结合释放垫。
6.2.2 样品垫的选择
用CB-SB08 、CB-SB06、Glass 33组装试纸条，各滴加100μl的样品，5min后比较样品垫对样品的吸收情况，比较NC膜上的检测线显色情况。
结果见表13。由表可知，3种样品垫都能完全吸收100μl样品，5min后Glass 33组装的试纸条检测线显色较其他两种颜色深，故选择Glass 33作为样品垫。
表13 样品垫选择结果
样品垫型号 样品吸收情况 检测线显色情况 6.2.3 吸收垫的选择
用Cotton linters 2668，Cotton linters 300， Cotton linters 900三种棉线纸张分别组装试纸条，比较各棉线纸张的厚度、对层析反应后样品溶液的吸收情况。结果见表14。
表14 吸收垫选择结果
吸收垫型号 层析后溶液吸收情况
2668 吸收完全
300 吸收完全
900 吸收完全
CB-SB08 吸收完全 ＋
CB-SB06 吸收完全 ＋＋
Glass 33 吸收完全 ＋＋＋
由表可知，3种吸收垫5min内都能将由NC膜层析过去的样品溶液吸收完全。3种膜的厚度分别为：0.90mm、1.83mm、2.59mm，考虑到Glass 33 厚度为0.37mm，NC膜AE 99的厚度为0.12mm，故Cotton linters 2668 与试纸条的其他材料匹配较佳。6.4 金标抗体喷涂量的选择
结合释放垫上金标抗体的喷涂量对试纸条的灵敏度有很大的影响，但金标抗体的喷涂量不是一个固定不变的值。胶体金标记抗体蛋白过程中，标记时胶体金溶液的pH值固定，稳定胶体金的最佳蛋白用量固定，标记时搅拌子转速固定，标记所用时
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间固定，但金标抗体在低温超速离心纯化后浓度有较大差异。同样的转速，超速离心后有时离心管管底有致密黑色金颗粒贴壁，有时没有，这必然导致纯化后金标抗体浓度的不同。不同批次的金标抗体在往结合释放垫上喷涂时都需要做预实验，先调节包被抗原浓度，调节金标抗体稀释倍数，组装少量试纸条测试SM2标准品，符合检测要求才能大量组装试纸条。
按每1cm2玻璃纤维素膜(Glass 33)喷涂40μl、50μl和60μl金标抗体，将稀释后的金标抗体滴加到玻璃纤维素膜上，干燥后分别组装试纸条。将阴性猪尿样本、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml的猪尿样本分别作6倍稀释，用组装好的试纸条进行测试。结果见表15。
表15 金标抗体喷涂量选择结果
金标抗体喷涂量（μl/cm2）
阴性样本(6倍) 30ng/ml(6倍) 50ng/ml(6倍) 70ng/ml(16倍)
40 － ＋ ＋ ＋
50 － － ＋ ＋
60 － － － ＋
从表中可知，金标抗体喷涂量为40μl/cm2时，检测6倍稀释的30ng/ml猪尿样本结果为阳性灵敏度过高，出现了假阳性现象，而金标抗体喷涂量为60μl/cm2时，检测6倍稀释的50ng/ml的猪尿样本，结果为阴性，即试纸条NC膜上能看到检测线，试纸条灵敏度降低。多次重复试验后，决定采用50μl/cm2作为Glass 33上金标抗体的喷涂量。
6.5 NC膜上抗原包被浓度的选择
在SM2抗体固定不变的情况下，影响试纸条灵敏度的因素主要是NC膜上包被抗原的包被浓度和结合释放垫上金标抗体的喷涂量。将包被抗原做系列稀释在NC膜上划线，和喷涂有不同浓度金标抗体的结合释放垫组装试纸条，检测SM2标准品，多次重复后可确定包被抗原的包被浓度。
将包被抗原溶液稀释到0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml，分别在NC膜上划线，干燥后分别滴加100μl 6倍稀释后的阴性猪尿样本、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml的猪尿样本。结果见表16。
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表16 包被抗原包被浓度选择结果
包被抗原包被浓度
（mg/ml） 阴性样本(6倍) 30ng/ml(6倍) 50ng/ml(6倍) 70ng/ml(6倍)
＋ ＋ ＋ ＋
－ － ＋ ＋
－ － － ＋
－ － － －
0.01
0.02
0.05
0.1
由表可知，当包被抗原包被浓度为0.01mg/ml时，检测线中包被的抗原量过少，滴加6倍稀释的阴性样本后，随样本溶液迁移到检测线位置的金标抗体同包被抗原结合后，滞留在检测线位置的胶体金颗粒数量过少，不足以达到肉眼可见程度，即检测线位置没有肉眼可见的红色线条出现，因而出现假阳性现象。同理，当包被抗原浓度为0.05mg/ml和0.1mg/ml时，检测灵敏度降低，无法满足检测需求。故包被抗原的包被浓度选择为0.02mg/ml。 7 试纸条的组装和测试 7.1 试纸条的组装
图4 试纸条组装示意图
如图4所示，在塑料背板上依次粘贴样品垫，结合释放垫，硝酸纤维素膜，吸收垫，并在样品垫外面粘贴保护膜。 7.2 试纸条的测试
每次用试纸条进行测试均需设对照试纸条：用移液枪在普通酶标板小孔中滴加
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磺胺二甲嘧啶胶体金免疫层析试纸条的技术报告
