蒸馏水 20 ____ 20 _____ _____ _____ 20 标准血清 _____ 样本血清 _____ A500nm 各管混匀，37℃反应6 min，以空白管校零。
A样本 胆固醇含量= A标准 ×标准血清浓度
实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定
[实验目的及要求]
学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。 [实验原理]
本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。
索氏提取器 (如图所示)利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。然后将固体
物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。
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[实验仪器及试剂]
索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。 全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。 [实验内容及步骤]
1、牛奶中水分含量的测定
准确称取一定量牛奶，吸附于70℃过夜烘干的层析滤纸上，70℃烘干后（约20分钟）称量，计算水分含量。
水分含量%=（M牛奶-M干物质）/M牛奶×100% M干物质=M带有干物质的层析滤纸-M层析滤纸 2、牛奶中粗脂肪含量的测定
将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘干2小时，取出，置于干燥器中冷却，然后用电子分析天平称重，并记录。将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹，称量后置索氏抽提瓶，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的2／3体积，恒温水浴加热，控制水温，以每小时回流3-5次为宜至抽提完全为止（用滤纸试）。取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100℃～105℃干燥 2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，重复操作至恒重。取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重。
计算 ：（1）粗脂肪含量%=（M提取前纸包-M提取后纸包）/M干物质×100%
（2）粗脂肪含量%=（M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶）/M干物质×100%
[注意事项]
1、乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。
2、抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。
3、装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。
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实验八 牛奶中酪蛋白的提取
[实验目的及要求]
掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法。 [实验原理]
酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%-82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。
[实验仪器及用品]
温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。 市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L。 [实验内容及步骤]
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1、酪蛋白等电点沉淀
将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。此时有絮状的蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温，放置分层 ，3000 r/min离心15 min，收集沉淀。
2、水洗
将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，离心10分钟，得到沉淀蛋白。
3、去脂
向粗制品中加入10 ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100mL牛 乳所制备出的酪蛋白质量（g/100 mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。
实验九 牛奶中酪蛋白含量的测定
[实验目的及要求]
1、学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量的方法。 2、掌握A224.0nm-A233.3nm测定蛋白含量的原理和方法。 [实验原理]
蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收。核酸及其衍生物有吸收紫外线的性质，其最高吸收峰在260nm处。由于核酸在280nm处也有光吸收，因此当蛋白质和核酸共同存在时，测定其中任何一种物质均存在干扰。核酸在230nm波长附近吸收值极小，如果将核酸测定值以230nm为中心，两侧存在对称而又相等的等吸收点，224nm波长处的吸收值和233.3nm波长处的吸收值相等。蛋白质则不同，从240nm波长处向短波长处移动时，其吸收值对波长的减小吸收值呈线性增加。因此，在240nm以下短波长一侧的核酸等吸收点中，如果测定蛋白质和核酸混合光密度值，两点间的光密度之差和蛋白质成比例关系。该方法是格罗夫斯等1968年建立起来的，能够对浓度为5-180微克/毫升的样品作微量测定。该方法有快速，灵敏，不破坏样品原有性质的优点，在测定完蛋白质含量后可用于其他分析。
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[实验仪器及试剂]
试管、移液管、容量瓶、烧杯、玻璃棒、UNICO-2000型分光光度计。 pH7磷酸缓冲液。 [实验内容及步骤]
用pH7的磷酸缓冲液溶解上次实验制得的酪蛋白，配置成5-180
g/ml的溶液，测定其在
224 nm波长处和233.3 nm波长处的光密度值。按公式C蛋白质（mg/ml）=(A224-A233.3)×210，计算浓度并反推回至每100 ml牛奶中的蛋白含量。 [注意事项]
1、在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时，280nm波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸和酪氨酸引起，但在224-240nm波长处的紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起，与苯丙氨酸，组氨酸，蛋氨酸，胱氨酸及半胱氨酸也有关，因此与其他吸收紫外线的不纯物质共同存在时，就会受到显著影响，这一点也应引起注意。
2、pH值对核酸测定的等吸收点有影响。
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生物化学实验教案(全)
