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表7血清尿素测定步骤
试剂／样品 空白试剂 应试剂 样品无蛋白滤液
反应管 5．0mL 0mL
0．25mL
空白管
O mL 反
5．OmL 0．25mL
轻轻颠倒混匀，孵育30 min。孵育结束后轻轻颠倒混匀，将各管液体依次倒人比色杯内约3 mL，340 am处测定 吸光度。
注：应使用符合测定性能的分光光度计和高准确度容量设备，分光光度测定的不确定度和样品体积的不确定度 宜用已知标准不确定度的测定程序确定；分光光度测定的吸光度扩展不确定度(^一2)不应超过1％；样品体 积部分的扩展不确定度(女一2)应该≤1％。
8．5测定范围
mmol·L“～30 mmol·L～。 血清尿素测定参考方法的线性为o
8．6误差的来源
8．6．1测定过程中器材和去离子水等如果受到氨离子的污染，干扰血清尿素的测定，；：莛结果假{生 偏高。
8．6．2高浓度氟化物会抑制尿素酶，引起血清尿素测定结果候性偏低。
8．6．3溶血(血红蛋白含量10 g·L。)、黄疸(胆红素含量1 mmol·L_1)干扰本洼测定，结果影啊 大于2％。
8．7测定样品要求
8．7．1
校准品、质控品、标准物质应严格按照运输条件和贮存条件运输和保存。
000 8．7．2静脉采血应空腹10 h～14 h，采血3mL，室温2 h内离心分离血清，离心速度3 r·min～，离 心时间10min。
9结果计算
9．1计算实际吸光度值 每份样本的测定包括样本吸光度值和空白吸光度值，经过空白校正的吸光度值为实际吸光度值，按
实际吸光度值一测定吸光度值一空白吸光度值。
9．2标准曲线的制作 用最小二乘法获得标准曲线斜率b和截距n，每个单独的吸光度作为非独立变异因素给出，浓度作
为独立因素使用，16个吸光度值和16个浓度用于8组数据分析。 设定倍增系数(F)一1／b；校正因数(c)一a／b 16个标准液的每一个实际测定浓度按公式(3)计算：
‘标％灌一A标^蕞×F—C
· (3)
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式中； c#＆t——标准液实际测定浓度，单位为毫克每分升
(rag·dL_1) A#$t——标准液实际吸光度值； F——倍增系数，等于1／b； C——校正因数，等于a／b。
9．3样品测定结果的计算 标准曲线符合通过标准后，按公式(4)计算样品浓度：
。#日一A#￡×F—C
式中：
。#目——样品测定结果，单位为毫摩尔(mmoI·L。)； A#g 样品实际吸光度值； F——倍增系数，等于1／b； c——校正因数，等于a／6。
9．4单位换算
以mg·dL-1单位表示的血清尿素浓度可通过乘以系数(，一O．167)转化成mmol·L～。
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附录A (规范性附录)
L-谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定
A．1测定试剂 A．1．1补充试剂原料
氯化铵(NHtel)，相对分子质量一53．49。 A．1．2试剂制备
A．1．2．1
125mmoi·L“的Tris-HCI
准确称取1．970 gTris—HCI，放人烧杯内，用80mL无氨水溶解后转移至100mL容量瓶内，用无氨 水补足至刻度线。密闭试剂瓶2℃～8℃保存。稳定2周。
A．1．2．2
125mmol·L“Tris-Base
准确称取1．514 3 g Tris～Base，放人烧杯内，用80 mL试剂水溶解后转移至100 mL容量瓶内，用试 剂水补足至刻度线。密闭试剂瓶2℃～8℃保存。稳定2周。
A．1．2．3
pH7．8，125mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液
的125 mmol·L Tris—HCl倒入烧杯内，用125 mmol·L～Tris—Base调节pH值至7．8； 密闭试剂瓶2℃～8℃保存。稳定2周。
100 mL
A．1．2．4溶液A
准确称取0．084 8 g d一酮戊二酸、0．008 9 g NADH、0．0931 g EDTA、0．062 7 g ADP分别用5mL pH 7．8、125 mmo[·L Tris—HCl缓冲液溶解后转移至50 mL容量瓶中，用Tris-HCl缓冲液充分冲洗 烧杯，使溶解成分全部转移至容量瓶中，用Tris—HCI缓冲液补足至刻度线。密闭试剂瓶2℃～8℃保 存，稳定2 d。
A．1．2．5反应试剂
准确称取0．334 3 g NH。el，用溶液A充分溶解后转移至25mL容量瓶中，用溶液A充分冲洗烧 杯，使溶解成分全部转移至容量瓶中，用溶液A补足至刻度线。密闭试剂瓶2℃～8℃保存，稳定2 d。
A．1．2．6
31 500 U·L“GLDH溶液
采用称量法依据L一谷氨酸脱氢酶厂家声明的含量获得总活性为63U L一谷氨酸脱氢酶，放入烧杯 内，用2 mL 0．2％牛血清白蛋白溶液完全溶解。密闭试剂瓶2℃～8℃保存。稳定1 d。
A．1．2．7
L一谷氨酸脱氢酶的稀释(使用前进行)示例
A．1．2．7．1在2．8mL 0．2％牛血清白蛋白溶液中加入0．1mLL一谷氨酸脱氢酶原液，充分混匀。第一 步的稀释比例是1：28。 A．1．2．7．2将步骤A．1．2．7．1中的0．1mL最终溶液加入到2．8mLl25mmol·L
0．2％牛血清白
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WS／T 345—2011 蛋白溶液中，充分混匀。第二步的稀释比例是1：28。第一步和第二步总稀释比例是1：841。
A．2测定条件
A．2．1
最终反应混合液的浓度 见表A．1。
表A．1 L_谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定最终反应混合液的浓度
参
TriS 100mm01．Lo
数 指 标
PH(30℃) 7．8士0 05‘
}酮戊二酸 6mmol·L叫 EDTA 4 rtlITL01．L叫 ADP 2mmol·L叫
NADH 0．2 ram01．L_1
NH．Cl 200 rnmol·L一1
样品与反应混合物体积比 0．20(1：5)
3扩展不确定度(女一2)。
A．2．2_L·谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定条件 见表A．2。
表A．2 L一谷氨酸脱氢酶催化活性浓度测定条件
参
温度
数
30．0℃土0．1℃4
339 r】ITL土1 nm‘
指 标
波长
带宽 ≤2 D．rn
光径
mm‘
10．00 mm士0．01
孵育时间
90 s
s 测定时间 连续监测孵育后120 8扩展不确定度(1—2)。
A．3测定 A．3．1试剂准备
将5mL反应试剂、0．6mLL一谷氨酸脱氢酶稀释液和0．6mL生理盐水放在30℃土0．2℃的水浴 箱中大约10 mln，使液体达到预定温度。
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A．3．2测定方法 按表A．3的顺序和量，将试剂和样品加入比色杯。
表A．3卜谷氨酸脱氢酶稀释液催化活性浓度测定步骤
反应液
2．000 raL
平衡到30℃
步骤A．1．2．7．2 L一谷氨酸脱氢酶溶液
0．500 133．L
充分混匀，孵育90 s。再连续监测120 s的吸光度。
A．3．3试剂空白
采用9 g·L-1(154mmol·L-1)氯化钠溶液代替L一谷氨酸脱氢酶溶液测定试剂空白，按上述步骤 进行操作。
A．4结果计算 通过回归分析(最小二乘法)计算吸光度随时间的改变[s_1(rain_1)]。减去试剂空白率后，即
GLDH储存液稀释液的吸光度变化率。按公式(A．1)计算储存酶溶液中GLDH催化活性浓度：
GLD日，。。k—F×F‰ X(AA／At)GLDH
注：此公式仅适用于按上述方法稀释与测定L一谷氨酸脱氢酶催化活性浓度。
(A．1)
式中：
GLDH，。t——酶原液中L一谷氨酸脱氢酶催化活性浓度，单位为微凯塔尔每升(肚at·L-1)或单
位每升(U·L_1)；
注：单位／xkat·L叫除以1 000可得mkat·L～，单位u·L-1除以1 000可得kU·L～。
F——系数，等于794(在339 nm波长测定，￡339(NADH)一630m2·mol，为IFCC与 IRMM推荐)；
FmI“。。——GLDH储存液的稀释因子，A．1．2．7中为841； (AA／At)。。。。——测定样品的实际吸光度变化率，单位为每秒(s-1)或每分(minl)。
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血清尿素测定参考方法
