SiRNA沉默HBx表达对HepG 2.2.15细胞增殖和凋亡的影响

SiRNA沉默HBx表达对HepG 2.2.15细胞增殖和凋亡的

影响

孙越鹏1，耿 磊2，李长福3，范 芳3

【摘 要】[摘 要] 目的 观察沉默HB x基因表达对肝癌细胞HepG2.2.15增殖和凋亡的影响。方法 用脂质体转染法将pSIHBV/X转染肝癌细胞HepG2.2.15，RT-PCR法检测HBx mRNA表达；ELISA法检测细胞上清液中HBsAb和HBeAg的表达情况；MTT法检测对细胞增殖的影响；AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。结果 pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后HBx mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01)；G2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；MTT法检测结果显示转染pSIHBV/X质粒后HepG2.2.15细胞的增殖受到抑制，AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示HBx siRNA可促进细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 靶向HBx基因的干扰质粒能降低HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg的水平、抑制HepG2.2.15细胞增殖，促进HepG2.2.15细胞凋亡。 【期刊名称】遵义医学院学报 【年(卷),期】2013(036)004 【总页数】5

【关键词】[关键词] RNA干扰；HBx基因；HepG2.2.15细胞；增殖；凋亡 肝细胞癌( hepatocellular carcinoma， HCC) 是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生是一个多阶段的病理学过程。我国是乙型肝炎的高发区，绝大部分肝癌患者存在过乙型肝炎病毒( heptis B virus，HBV)的感染，HBV是HCC的致病

因子已得到公认，HBV x基因编码的HBV X蛋白与肝癌的发生密切相关，可通过反式激活作用干扰宿主细胞的增殖、调节细胞周期及凋亡[1-2]。HepG2.2.15细胞是含有HBV基因的肝癌细胞，是研究HBV的细胞模型系统[3]。本实验应用RNA干扰技术沉默HBx基因，观察抑制HBx基因表达对HepG2.2.15细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 肝癌细胞株HepG2.2.15购自博慧斯生物技术公司；pSIHBV/X与对照质粒pTZU+1由泸州医学院张建军教授惠赠；质粒扩增菌种DH5α、内切酶等购于宝生物有限公司；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶为美国GIBCO产品；胎牛血清购于Hyclone公司；Lipofectamine2000为Invetrogen公司产品；ELISA试剂盒购自华美生物工程公司；AnnexinV-FITC/PI双染试剂购自与Sigma公司。

1.2 实验分组及质粒转染 实验共分4组：以未转染的细胞作为空白对照组(control group)；仅加脂质体的细胞作为脂质体组(LipofectamineTM2000 group)；以转染阴性对照质粒细胞作为质粒对照组(control plasmid group)；以转染pSIHBV/X质粒细胞作为pSIHBV/X实验组(pSIHBV/X group)。利用脂质体LipofectamineTM2000将pTZU+1与pSIHBV/X质粒转入细胞(操作步骤同说明书)：选取对数生长期细胞，待细胞融合度为80%时进行转染，6 h后更换正常培养基培养，继续培养24 h、48 h、72 h。

1.3 RT-PCR检测HBx基因的表达 RT-PCR分析转染后24 h各组细胞HBx基因的表达情况，使用HBx引物为：上游5′-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3′，下游3′-ATGTACGGCTGGAGGTCTGTCA-5′，扩增长度为463 bp。用RNA抽

提试剂盒分别提取每组细胞总RNA，按试剂盒说明书进行RT反应，以10 μL RT产物为模板，分别扩增β-actin和HBx基因片段。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，将结果用凝胶成像系统扫描灰度值，以各组目的基因与内参的灰度比值作为相对表达量，比较各组之间的差异。

1.4 ELISA法检测HBsAb和HBeAg的表达 将pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞，收集转染前后细胞培养液，采用HBsAb和HBeAg诊断试剂盒及ELISA方法检测HBsAb和HBeAg的表达情况，计算抑制率。抑制率=(1-实验孔OD值/空白对照孔OD值)×100%。

1.5 MTT法检测各组细胞的增殖 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔接种1×104个。培养12 h后，洗掉培养液，换1%胎牛血清的低血清培养基同步化12 h。依实验分组进行细胞转染，放入CO2培养箱中培养。时间到后，洗掉培养液，加入不含胎牛血清的培养基100 μL，、50 μLMTT溶液，继续培养4h后，酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度值，计算转染24 h、48 h、72 h后细胞增殖情况。

1.6 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培养液接种于铺有盖玻片的24孔板中，每孔接种2×104个。培养12 h后，按照脂质体转染法进行转染。取800 μL的Binding Buffer加入8 μL AnnexinV-FITC和8 μL Propidium Iodide(PI)，避光，室温反应5 min。高倍镜下随即取5个视野，在荧光显微镜下观察拍照并计算平均凋亡指数(凋亡指数 = 每高倍视野凋亡细胞数/每高倍视野细胞总数×100 %)。 1.7 统计方法 实验结果用均数±标准差或百分比表示，用SPSS13.0统计软件包进行分析，方差分析检验。实验结果以P<0.05认为差异有统计学意义。