实验报告
实验名称 院 系 姓 名 抗血清制备及效价测定—血清抗体效价的测定 医学院 专 业 医检 学 号 实验日期 班 级 一、实验目的 了解酶联免疫吸附试验(ELISA)的原理及优点，学习ELISA的操作过程。 二、实验器材 试剂： 洗涤液、待检血清、阴性血清、二抗液、显色液、锡箔纸 器材： 培养箱、洗板机、酶标板 三、实验原理 酶联免疫技术的一种，可将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的高效性相结合而建立的一种检测技术，其基本原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，当酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液的参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量呈比例关系，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。ELISA技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。 四、实验过程及步骤 ELISA检测血清抗体效价 1.在酶标板第1排4孔加入198微升洗涤液，第2-11排4孔加入100微升洗涤液，第12排加入99微升洗涤液。 2.在第1排孔中加入2微升待测血清，第12排孔加入1微升阴性血清。 混匀第一排溶液，重复6~8次，从中吸出100微升移动到第二孔。按同样方法混合均匀，并往后面继续稀释到第11孔，弃去第11排孔吸出的100微升。 3.将酶标板置于37℃温箱孵育30min。 4.取出酶标板，置于洗板机中洗涤。（一抗反应结束，弃去反应液，洗涤酶标板4次） 5.给酶标板每个孔加100微升二抗液。 6. 将酶标板置于37℃温箱孵育30min。 7. 取出酶标板，置于洗板机中洗涤。（二抗反应结束，弃去反应液，洗涤酶标板5次） 8. 给酶标板每个孔加100微升显色液。 9.在酶标板上覆盖锡箔纸，置于暗处反应10min。再给酶标板每个孔加入50微升终止液。 10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。结果如下所示： 五、实验总结 思考题： 1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？ 答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。 ①直接 ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 ②间接法 ELISA 原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 ③双抗夹心法 ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 ④竞争法 ELISA 原理：竞争法 ELISA 最为复杂，通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体，当样品中的游离抗原越多，就可结合越多的抗体，而固相抗原只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物，只留下固相抗原与抗体的结合物。显示经计算可得样品中抗原的含量。竞争法可根据实验设置直接法、间接法或夹心法形式。 六、教师评价
血清抗体效价的测定
