4）病毒悬液 → 接种培养
观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。 5）未接种病毒的细胞 → 培养 观察细胞生长是否正常。 （2）悬液定量操作程序 1）第 1 组。吸取消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
2）第 2 组。吸消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
4）第 4 组。 吸取病毒悬液 0.1 ml， 加细胞维持液 0.9ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
5）第 5 组。 向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。 （3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格: 1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。
2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。 3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。 4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。 2.1.1.10.7 脊髓灰质炎病毒灭活试验
（1）目的
在试验室内测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，作为制定病毒污染物消毒实用剂量的依据。
（2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。
（3）试验分组
1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。
2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。
3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。
3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。 （4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入合格中和剂中
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混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。
5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。 6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。 7）试验重复3次。
8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。
9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。
接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶， 放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟， 用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：
pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数
注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。 （5）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = ㏒ N0 ― ㏒ Nx
（6）评价规定
1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。
2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间。
（7）注意事项
1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。 2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.8 艾滋病病毒灭活试验
（1）目 的
在试验室内测定消毒剂对艾滋病病毒（human immunodeficiencyvirus，HIV）灭活所需的剂量，作为制定对该病毒污染物消毒实用剂量的依据。
（2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。
（3）安全防护
试验中要求采取严密防护措施。 我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。 在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。
（4）试验分组
1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。 所设组应
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能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。
2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。
3）阴性对照组。 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
4）消毒剂对细胞毒性组。 取 100μl 待测消毒剂，加入含有100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/ml）的 96 孔培养板内。 置二氧化碳温箱（37℃）中培养 7 d，观察细胞生长情况，确定消毒剂对细胞无毒性的最高稀释度。
（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后， 转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验。
2）从液氮中取出冻存 HIV-1 毒种，接种于含 10ml 细胞悬液（含细胞 700 000个/ml～800 000 个/ml）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于 -80℃ 备用。 如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。
3）取待测消毒剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视消毒剂的类型和实验目的，确定最高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌。
4）取 50μl 待检消毒剂，与 50μl 病毒原液混合。在规定温度作用一定时间（根据试验要求确定作用时间和温度），立即加入0.9ml 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（400 000 个/ml），在37℃，放置 40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂；消毒剂对细胞毒性组试验中，用无菌去离子水代替病毒。
5）取出反应管，立即采取去除残留消毒剂处理。处理可用物理去除法或中和剂法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留消毒剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。
6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/ml）。 同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10 系列稀释，然后取 100μl 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的 96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。
7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。 第 4 d，在各反应孔内补加 50μl 新鲜完全培养基。第7d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
8）试验重复 3 次。 （6）评价规定
1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该消毒剂浓度与作用时间，对HIV污染物消毒的实验室试验合格。
2）在正常情况下，HIV阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在5～7之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无HIV 检出。所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV悬液浓度，或选择适宜消毒液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。
（7）注意事项
1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须绝对遵守BSL3实验室的安全制度。身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。
2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。
3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善消毒处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。
4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。
5）因试验难度较大，试验前应尽量考虑周密，特别对各组剂量和组距的合理安排等方面，以能最终做出正确的结论。 2.1.1.12 能量试验
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2.1.1.11.1目的
测定连续加入细菌悬液对消毒剂杀菌作用的影响, 以作为确定该消毒剂用于多次消毒污秽物 品(含较多有机物),如浸洗拖布的消毒液、浸泡污染医疗器械的消毒液、浸泡洗手消毒液等实用浓度的参考。 2.1.1.11.2 试验器材
(1) 试验菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌 8099 绿脓杆菌 ATCC 15442 (2)磷酸盐缓冲液 (PBS,0.03mol/L,pH值7.2～7.4)。 (3)标准硬水(硬度为 342mg/L)：见附录A。
(4)含中和剂营养肉汤培养基 (所用中和剂应为经试验鉴定合格者, 见 2.1.1.5)。 (5)细菌定量杀灭试验所用器材 (见 2.1.1.7.2)。 2.1.1.11.3试验程序
(1)试验用菌悬液配制 选择上述试验菌中对所试消毒剂抗力强者作为试验菌, 配制菌悬液。用标准硬水将酵母粉配成50mg/L 溶液 (pH值6.9～7.1)。然后,吸取试验菌新鲜营养肉汤24h 培养物6.0ml, 加于含 4.0ml酵母液试管中, 混匀。依此配制成的菌悬液, 所
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含菌量应为 10 cfu/ml～10cfu/ml。
(2)将待测消毒剂用硬水稀释成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x) 等3 个浓度的消毒液 (括弧中的 “x” 代表杀菌试验所得有效浓度), 各取 3.0ml 分装于无菌试管内。
(3)第 1 次,取试验菌悬液 1.0ml 加入到第 1 管 A 浓度消毒剂溶液内, 立即混匀。 (4)在 A 管加菌悬液后8min,分别吸取A管内混合液20μl移种至A组的第1批5支盛有 5.0ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。 (5)在第1 次加菌悬液后10min，第2次取1.0ml菌悬液加入到A浓度消毒剂管内,立即混匀。
(6)在第2次加入菌悬液后8min(即第1次加菌悬液后18min) 时, 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第2批5支盛有5ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。
(7)在第2次加入菌悬液后10min(即第1次加菌后20min),取1.0ml 菌悬液加入到 A 浓度消毒剂管内，振摇混匀。
(8)在第3次加入菌悬液后8min(即第1次加入菌液后28min) 时, 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第 3 批 5支盛有5ml 含中和剂的营养肉汤培养基管中。
(9)B(x)、C(0.5x)两浓度药液的试验内容和操作程序,与上述A浓度者相同。3 个稀释度消毒药液同一批进行操作时, 可按表2-3 规定的时间和顺序进行。
表 2-3 能量试验操作时间 加菌与移种次序 各浓度组操作时间(第 X min) A B C 第 1 次加菌 0 1 5 第 1 次移种(5 管) 8 9 13 第 2 次加菌 10 11 15 第 2 次移种(5 管) 18 19 23 第 3 次加菌 20 21 25
第 3 次移种(5 管) 28 29 33
(10)以2支含5ml中和产物 (用同次试验所用消毒剂与中和剂配制) 的营养肉汤培养基管, 加入5μl试验菌液, 作为阳性对照。
(11)以2支含 5ml与上相同的中和产物的营养肉汤培养基管, 作为阴性对照。
(12)将以上各试验组和对照组样本管,置 37℃ 培养箱中培养 48h, 观察是否有菌生长 (13) 所有试验均在20℃±2℃ 水浴中进行。
(14)重复上述试验, 每日 1 次, 以连续取得 3次同一评价结论者为准。
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(15)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数,其长菌量应在10cfu/ml～7
10cfu/ml。阳性对照管应变浑浊, 阴性对照, 不应有菌生长。
对照组结果不符合要求时, 应检查原因, 改正后重新进行试验。 2.1.1.11.4 评价规定
当阳性对照管有细菌生长(混浊),阴性对照管无菌生长(透明)时,第 1 次和第 2 次移种的 5管样本中,有 2 管或 2管以上不长菌的浓度组, 作为合格浓度组。如 3 个浓度组均
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合格, 应降低消毒药液浓度继续试验; 反之,3 个浓度组均不合格, 则增加消毒剂浓度,直至找到最低合格浓度。连续3次重复试验, 得到同样最低合格浓度, 该最低合格浓度可作为设定反复浸泡用消毒液实用浓度的依据。 2.1.1.11.5 结果举例
设对某消毒剂能量试验结果如表 2-4。
表 2-4 某消毒剂能量试验结果
试验序号 消毒剂浓度 3 次加菌后移种 5 管肉汤中细菌生长情况
(%,v/v) (1) (2) (3) 1 0.6 - - - - - + + + + + + + + + + 1.2 - - - - - - + + + - + + + + + 1.8 - - - - - - - - - - - - - - - 2 0.6 + - + + + + + - - + + + + + + 1.2 - - - - - - - - + + + + + + + 1.8 - - - - - - - - - - - - - - + 3 0.6 - - + + + + + - + + + + + + + 1.2 - - - - - + - - - - + + + + + 1.8 - - - - - - - - - - - - - - -
注: \表示有菌生长, \表示无菌生长。
结论: 此次试验结果, 该消毒剂的最低合格浓度为 1.2%。 2.1.1.11.6 注意事项
(1)试验应选用规定菌株。
(2) 3 个消毒剂浓度组操作, 应严格按表 2-3规定的时间进行。 2.1.1.12 各种因素对消毒剂杀菌作用影响的测定 2.1.1.12.1 目 的
了解有机物、温度和 pH 对消毒剂杀菌作用的影响规律，为制定消毒剂的实用剂量提供参考。
2.1.1.12.2 试验器材
（1）菌片与菌悬液（按 2.1.1.2 要求和方法制备）。 （2）恒温水浴箱。
（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温） （4）温度计。 （5）pH 计。
（6）有机物,根据消毒剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨。 （7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格）。 （8）盐酸（用无菌蒸馏水配制）。 （9）氢氧化钠（用无菌蒸馏水配制）。 2.1.1.12.3 试验微生物的选择
根据所测消毒剂鉴定需要决定。一般情况下，除需用于特定微生物者外，对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性细菌的代表即可；用作灭菌剂，可使用枯草杆菌黑色变种芽孢。
2.1.1.12.4 消毒液浓度和作用时间的设定
各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度，和 3个～4 个作用时间进行杀灭试验。在 3个～4 个作用时间中，以该最低有效浓度所需的最短有效时间为第 1 时间（T），其后的第 2 时间为第 1 时间的一倍（2T）。 依此，第 3 时间为 3T，第 4 时间为 4T。试验结果应根据需要测出杀灭对数值达 5.00（消毒用）的最低有效剂量。必要时，可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间，若第 1 时间较长（> 30min），可根据情况适当缩短作用时间的组距。对第1 时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。
2.1.1.12.5 有机物对杀灭微生物效果影响的测定
（1）如以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含25% 小牛血清组；含 50% 小牛血清组等 3 组。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）以稀释液配制的微生物悬液与无菌小牛血清，按 1：1 与3：1 比例混合，分别
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消毒技术规范
