(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。
(5) 磷酸盐缓冲液( PBS, 0.03 mol/L,pH7.2)。 (6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。 （7）有机干扰物质：见附录A。
(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。
(9) 恒温水浴箱。
（10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。 （11）电动混合器。 （12）计时装置。 2.1.1.9.3 真菌悬液制备
（1）白色念珠菌悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。 4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2） 黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。 1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置 30℃±1℃ 培养 42h～48h。用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA 培养基平板，置 30℃±1℃ 培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置 30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。
2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置 30℃±1℃ 培养 42h～48h。
3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后,滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。
5) 使用时，可用稀释液适当稀释。
6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法,每片加菌悬液10μl。染菌后，置 37℃ 培养箱内烤干(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。
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7) 回收菌数应达5×10cfu/片～5×10cfu/片，可依试验要求确定。 2.1.1.9.4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组,按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间, 对受试菌种的杀灭能力进行测定。
(2) 阳性对照组, 以稀释液代替消毒剂溶液,按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所
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得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组,观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.1.9.5 试验程序
常用杀灭试验有: 悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.5.4, 只是培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。
活菌培养计数时, 对白色念珠菌，在 37℃ 培养箱中培养72h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃ 培养箱中培养 72h 观察最终结果。 2.1.1.9.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均 ≥5.00,可判定该产品对真菌污染物消毒合格。对所试特定真菌的杀灭对数值均 ≥ 5.00,可判定该产品对特定真菌污染物消毒合格。
(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值均应 ≥5.00,在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，3 次试验中允许有一次试验杀灭对数值应< 5.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。
用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，3次试验中允许有一次试验杀灭对数值应<3.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。 2.1.1.9.7 注意事项
(1) 黑曲霉菌试验操作应在 Ⅱ 级生物安全柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。
(2) 其它注意事项见 2.1.1.7.8。 2.1.1.10 病毒灭活试验 2.1.1.10.1 适用范围
本章内容主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。 2.1.1.10.2 试验器材
（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。
（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1疫苗株的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。 （4）恒温水浴箱。 （5）二氧化碳培养箱。 （6）层流超净工作台。
（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。 （8）液氮罐。 （9）倒置显微镜。 （10）离心机。
（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。 （12）细胞维持培养基：见附录A。 （13）细胞完全培养基：见附录A。 （14）去离子水。
2.1.1.10.3 病毒悬液的制备
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（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min,3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）收获后，将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min,15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。
（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。
2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法
（1） 终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。
TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例
（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。
具体计算方法如下：
1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。
各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。
2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：
距离比例?高于50%组的病变率?50
高于50%组的病变率?低于50%组的病变率3）计算举例
设试验数据如表 2-2
表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果 样本 接种 细胞病变 累积值 稀释度 孔数 - + 细胞病变细胞病变
(-) (+)
-410 4 0 4 0 12 -510 4 0 4 0 8 -610 4 1 3 1 4 -710 4 3 1 4 1 -810 4 4 0 8 0
病变比
病变率
（%） 100 100 80 20 0
12/12 8/8 4/5 1/5 0/8
本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为 6。
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距离比例?
80?50?0.5
80?20TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5
（2）噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。
每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数
（3）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = ㏒ N0 ― ㏒ Nx
2.1.1.10.5 残留消毒剂化学中和法的鉴定试验
（1）目 的
本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。 （2）试验设计原则
1） 通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。
2） 根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。
3） 中和试验用药物浓度应为正式消毒试验最高浓度。作用时间最短不得少于30s。 （3）试验分组
在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。
预备试验:
1）中和剂 + 细胞 → 培养
观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。 2）（消毒剂 + 中和剂）+ 细胞 → 培养 观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。 3）（消毒剂 + 细胞）→培养 观察消毒剂对细胞生长有无影响。 正式试验:
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察所试消毒剂对病毒有无抑制或灭活作用。
2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 中和剂 → 接种细胞培养
观察残留消毒剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。 3）中和剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养 观察中和剂对病毒有无抑制作用。
4）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 → 接种细胞培养 观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。
5）病毒悬液 → 接种细胞培养
观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。 6）未接种病毒的细胞 → 培养 观察其生长是否正常。
（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序
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根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。
1） 预备试验第 1 组。 将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h 后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
2）预备试验第 2 组。将试验用细胞， 分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4 h 后，吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的消毒剂，作用 3h～4h后，吸去消毒剂，另加细胞维持培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
4）正式试验第 1 组。 吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该最终样液 （或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。
5）正式试验第 2 组。 吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀，作用 10 min。进行随后的病毒滴度测定。
6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。 待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度消毒剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，加入 1.0 ml 中和剂，再吸加 0.5 ml病毒悬液，混匀，作用 10 min。进行随后的病毒滴度测定。
8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。
（5）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1） 正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。
2） 正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。
3） 正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。 4） 正式试验中第 6 组细胞生长正常。
5） 预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的最高浓度下对细胞生长无影响。
6） 连续 3 次试验取得合格评价。 （6）注意事项
病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.6 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验
病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。
（1）分 组
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种培养
观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。 2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 除药处理 → 接种培养 观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。 3）病毒悬液 + 除药处理 → 接种培养 观察除药处理对病毒滴度有无影响。
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消毒技术规范
